Em 2005, começou a actuar regularmente na The Comedy Store em West Hollywood, Califórnia. Maniscalco cita Jerry Seinfeld, George Carlin, Brian Regan, John Ritter, Johnny Carson, Andrew Dice Clay, Bill Burr, e Don Rickles como influências cómicas. Desde então, ele fez meia hora para a Comedy Central Presents e cinco horas de especiais. O seu primeiro especial, Sebastian Live, foi lançado a 2 de Junho de 2009. Os seus três especiais seguintes foram exibidos no Showtime, com What’s Wrong with People? lançado a 5 de Janeiro de 2012, Aren’t You Embarrassed?, gravado em Chicago, lançado a 14 de Novembro de 2014, e Why Would You Do That?, gravado em Nova Iorque e lançado em 2016.
Maniscalco foi um dos quatro comediantes apresentados no Wild West Comedy Show de Vince Vaughn: 30 Dias & 30 Noites – Hollywood to the Heartland, juntamente com Ahmed Ahmed, John Caparulo, e Bret Ernst. Maniscalco esteve na melhor noite de Russell Peters, Comedy Central Presents, The Late Late Show with Craig Ferguson, The Tonight Show with Jay Leno, The Jay Leno Show, The Tonight Show Starring Jimmy Fallon, Conan, e The Late Show with Stephen Colbert. Adicionalmente, apareceu em vários filmes, tais como The Nut Job 2: Nutty by Nature, The House, Tag, e Cruise, e tem um podcast intitulado The Pete and Sebastian Show com o companheiro comediante Pete Correale. A partir de Janeiro de 2017, eles têm um programa no canal 99 da Raw Dog Comedy da rádio satélite Sirius XM. Em 2016, Maniscalco apareceu na sétima temporada de Comediantes em Carros a Tomar Café. Publicou o seu livro de memórias Stay Hungry em 27 de Fevereiro de 2018. Um especial da Netflix também intitulado Stay Hungry foi lançado a 15 de Janeiro de 2019.
Em 2018, Maniscalco fez a sua estreia na longa-metragem, como Johnny Venere no filme premiado com o Oscar Green Book. Maniscalco recebeu os Prémios de Música de Vídeo da MTV de 2019 a 26 de Agosto. Em Novembro de 2019, Maniscalco apareceu em Martin Scorsese’s The Irishman tocando “Crazy” Joe Gallo ao lado de Robert De Niro, Joe Pesci, e Al Pacino. Acolheu também o podcast em três partes do filme, publicado pela primeira vez em 2 de Dezembro de 2019, intitulado Behind the Irishman.