En 2005, comenzó a actuar regularmente en The Comedy Store en West Hollywood, California. Maniscalco cita a Jerry Seinfeld, George Carlin, Brian Regan, John Ritter, Johnny Carson, Andrew Dice Clay, Bill Burr y Don Rickles como influencias cómicas. Desde entonces, ha hecho una media hora para Comedy Central Presents y cinco especiales de una hora. Su primer especial, Sebastian Live, se estrenó el 2 de junio de 2009. Sus siguientes tres especiales se emitieron en Showtime, con What’s Wrong with People? publicado el 5 de enero de 2012, Aren’t You Embarrassed?, grabado en Chicago, publicado el 14 de noviembre de 2014, y Why Would You Do That?, grabado en la ciudad de Nueva York y publicado en 2016.
Maniscalco fue uno de los cuatro cómicos que participaron en el Wild West Comedy Show de Vince Vaughn: 30 Days & 30 Nights – Hollywood to the Heartland, junto con Ahmed Ahmed, John Caparulo y Bret Ernst. Maniscalco ha participado en Best Night Ever de Russell Peters, Comedy Central Presents, The Late Late Show with Craig Ferguson, The Tonight Show with Jay Leno, The Jay Leno Show, The Tonight Show Starring Jimmy Fallon, Conan y The Late Show with Stephen Colbert. Además, ha aparecido en varias películas, como The Nut Job 2: Nutty by Nature, The House, Tag y Cruise, y tiene un podcast titulado The Pete and Sebastian Show con el también cómico Pete Correale. Desde enero de 2017, tienen un programa en el canal 99 de Raw Dog Comedy de la radio por satélite Sirius XM. En 2016, Maniscalco apareció en la séptima temporada de Comedians in Cars Getting Coffee. Publicó sus memorias Stay Hungry el 27 de febrero de 2018. Un especial de Netflix también titulado Stay Hungry fue lanzado el 15 de enero de 2019.
En 2018, Maniscalco hizo su debut en el cine, como Johnny Venere en la película ganadora del Oscar Green Book. Maniscalco fue el anfitrión de los MTV Video Music Awards 2019 el 26 de agosto. En noviembre de 2019, Maniscalco apareció en The Irishman de Martin Scorsese interpretando a «Crazy» Joe Gallo junto a Robert De Niro, Joe Pesci y Al Pacino. También fue anfitrión del podcast de tres partes que acompaña a la película, publicado por primera vez el 2 de diciembre de 2019, titulado Behind the Irishman.