Estudos de mapeamento do destino
Identificar as origens celulares dos tecidos regeneradores é uma questão fundamental na biologia da regeneração. Vários estudos têm realizado análises de mapeamento do destino para investigar a origem celular do músculo cardíaco durante a regeneração do coração em zebrafish. Utilizando técnicas de mapeamento do destino genético induzível (Buckingham e Meilhac, 2011), dois estudos examinaram directamente a contribuição dos cardiomiócitos para o coração regenerado em zebrafish (Jopling et al., 2010; Kikuchi et al., 2010). Em ambos os casos, foram utilizadas duas linhas transgénicas: uma linha contém um gene 4-hidroxiamoxifeno (4-HT) – induzível Cre recombinase (CreER) a partir do qual a expressão é impulsionada nos cardiomiócitos pelo promotor do gene da cadeia leve da miosina cardíaca 2 (cmlc2), também conhecido como gene da cadeia leve da miosina 7 (myl7); e a outra é uma linha indicadora na qual a expressão da proteína fluorescente verde reforçada (EGFP) pode ser induzida nas células de expressão de CreER após a excisão da cassete de paragem transcripcional loxP-flanked por tratamentos 4-HT (Jopling et al., 2010; Kikuchi et al., 2010). Utilizando este sistema, quase todos os cardiomiócitos que expressam cmlc2 foram pré-rotariados com EGFP por tratamentos 4-HT antes da lesão, e as experiências de regeneração foram realizadas 30 dias após a ressecção ventricular. Os resultados de ambos os estudos mostraram claramente que a grande maioria do miocárdio regenerado é rotulado com EGFP, sem diferença significativa detectada na proporção de cardiomiócitos EGFP+ no tecido regenerado em comparação com os ventrículos não lesionados, indicando que os cardiomiócitos cmlc2+ existentes, mas não cmlc2- não miócitos, são a principal fonte de músculo novo durante a regeneração do coração zebrafish.
Células derivadas do epicárdio (EPDCs) demonstraram anteriormente contribuir e regular a vascularização durante a regeneração cardíaca em zebrafish (Kim et al.., 2010; Lepilina et al., 2006); contudo, a sua contribuição para a regeneração do miocárdio não foi directamente testada. Estudos recentes abordaram esta questão utilizando duas abordagens diferentes: mapeamento do destino genético (Kikuchi et al., 2011a) e transplante (González-Rosa et al., 2012). No estudo de mapeamento do destino genético induzível, as sequências cis-reguladoras do factor de transcrição 21 (tcf21), também conhecido como Epicardin (Robb et al., 1998), Pod1 (Quaggin et al., 1999), Capsulin (Hidai et al., 1998; Lu et al., 1998), foram utilizados para direccionar o CreER para o epicárdio do zebrafish (Serluca, 2008), e a sua descendência foi rastreada durante a regeneração após a rotulagem dependente do CreER com EGFP, que foi induzida a partir de uma linha indicadora com um tratamento 4-HT transitório. No ensaio de transplante, foi recolhido um pedaço de tecido cardíaco do ventrículo ferido da estirpe β-actin:EGFP, no qual a maioria das células cardíacas, incluindo as células epicárdicas, foram rotuladas com EGFP, e transplantadas para um coração do tipo selvagem recentemente ferido que tinha sido irradiado antes da lesão para suprimir a proliferação de células no tecido receptor. Em ambos os estudos, foram detectadas muitas células com destino mapeado no regenerado e histologicamente caracterizadas como miofibroblastos (González-Rosa et al., 2012) e células perivasculares (González-Rosa et al., 2012; Kikuchi et al., 2011a), mas não como cardiomiócitos (González-Rosa et al., 2012; Kikuchi et al., 2011a). Estes resultados indicam que o epicárdio ou EPDCs não dão origem a músculo cardíaco durante a regeneração do coração zebrafish, o que é consistente com a descoberta de que os cardiomiócitos são a principal fonte de regeneração do miocárdio.
As experiências de rastreio de linhagem descritas acima não abordaram se a população cmlc2+ inclui múltiplos tipos de células musculares que podem contribuir de forma diferente para a regeneração. Recentemente, Poss e colegas geraram um sistema transgénico que permite a etiquetagem clonal multicolor dos cardiomiócitos, e definiram linhagens miocárdicas anteriormente não caracterizadas, ao mesmo tempo que revelavam os seus comportamentos durante a morfogénese do coração zebrafish (Gupta e Poss, 2012). Este sistema consistia em dois alelos transgénicos, cmlc2:CreER (Kikuchi et al., 2010) e uma cassete de repórter multicolor chamada priZm, que foi construída utilizando a tecnologia Brainbow originalmente desenvolvida para visualizar neurónios individuais e ligações no cérebro do rato (Livet et al., 2007) (Fig. 1A). Utilizando este sistema, os autores induziram a etiquetagem clonal multicolor a 2 dias após a fertilização, e realizaram análises de imagem em várias fases de desenvolvimento para caracterizar em detalhe como os clones cardiomiócitos se comportam durante a morfogénese do coração.
Figure 1. Novas fontes celulares para o músculo cardíaco. (A) Um sistema transgénico para a etiquetagem clonal multicolor dos cardiomiócitos. A cassete priZm exprime uma proteína de repórter fluorescente vermelha (RFP) como cor padrão sob o controlo do promotor β-actin2. A recombinação diferencial entre os sítios emparelhados lox2272 (triângulo preto) ou loxP (triângulo branco) induz a expressão de proteína fluorescente ciano (CFP) ou proteína fluorescente amarela (YFP), respectivamente. A estirpe transgénica priZm transporta inserções multicópia em tandem da cassete indicada num único locus genético, e eventos limitados de excisão mediados pela Crema nos sítios loxP ou lox2272 produzem muitas cores permanentes possíveis com várias combinações de expressão RFP, CFP, e YFP. Esta estratégia permite a etiquetagem clonal multicolor de cardiomiócitos no duplo contexto transgénico com a estirpe cmlc2:CreER (Kikuchi et al., 2010) após tratamentos com tamoxifen (Gupta e Poss, 2012). (B) Linhagens musculares no ventrículo zebrafish. Tr, músculo trabecular; Pr, músculo primordial. (C) Regeneração de células musculares primordiais e corticais. Setas e pontas de seta nos painéis médio e direito indicam o bordo de clones migratórios da camada muscular primordial e a parede ventricular reparada pela camada muscular cortical, respectivamente. Linha pontilhada: plano de amputação. A figura é um resumo do trabalho de Poss e colegas (Gupta e Poss, 2012).
O ventrículo zebrafish foi reconhecido por conter dois tipos de músculo cardíaco, compreendendo uma parede periférica denominada camada compacta e uma camada trabecular interna (Hu et al., 2001). Foi demonstrado que a formação de trabéculas ocorre através da delaminação de cardiomiócitos do músculo da parede ventricular (Liu et al., 2010). A abordagem de marcação clonal descrita acima refinou esta compreensão anatómica e de desenvolvimento do coração zebrafish. Primeiro, os autores descobriram que a parede muscular externa do tubo do coração embrionário persiste mesmo no ventrículo adulto. Para acomodar o crescimento cardíaco, esta camada muscular expande-se apenas circunferencialmente durante toda a vida do peixe, mantendo uma espessura de um único cardiomiócito, tal como se vê no coração embrionário. Esta linhagem muscular, denominada músculo primordial, persiste para formar a camada mais interna da parede muscular periférica do ventrículo adulto (Fig. 1B, painel direito). Em segundo lugar, os autores observaram que na fase juvenil, a camada muscular primordial é penetrada por alguns clones de cardiomiócitos trabeculares – ~ 8 clones por ventrículo – como eventos raros e espacialmente segregados, e estes clones de cardiomiócitos dominantes crescem sobre toda a camada primordial, criando outra parede muscular que constitui a camada mais externa da parede muscular periférica do ventrículo adulto (Fig. 1B). Esta linhagem muscular é claramente distinta da linhagem muscular trabecular e primordial, e tem sido denominada a camada muscular cortical. Assim, na visão refinada, o ventrículo zebrafish adulto consiste em três linhagens musculares diferentes, músculo primordial, trabecular e cortical, e estas linhagens desenvolvem-se nesta sequência temporal durante o desenvolvimento (Gupta e Poss, 2012).
Após a definição das linhagens musculares distintas, uma questão interessante a colocar é se estas linhagens contribuem de forma diferente para a regeneração do coração. Os autores realizaram experiências de regeneração utilizando ventrículos de cmlc2:CreER adulto; peixes premiados em que a etiquetagem clonal multicolor tinha sido induzida numa fase embrionária, tal como descrito acima. Aos 14 dias após a lesão, os clones musculares corticais adjacentes à ferida expandiram-se nas direcções lateral e radial no local da lesão, mas a integração das células musculares primordiais não ocorreu neste momento (Fig. 1C, painel médio). Em 30 dias após a lesão, à medida que o músculo cortical reconstruía a parede muscular, os clones da camada muscular primordial tornavam-se detectáveis na regeneração, e uma camada primordial completa era restaurada, formando um limite de uma única camada celular entre o músculo cortical trabecular e regenerado em 60 dias após o trauma (Fig. 1C, painel direito). Assim, tanto a camada muscular primordial como a cortical contribuem para a regeneração, mas são formadas em ordem inversa em relação à sequência de desenvolvimento normal. O músculo primordial expande-se apenas circunferencialmente, como observado durante a morfogénese cardíaca, enquanto que o músculo cortical expande-se de forma menos restrita e contribui para a maior massa da nova parede ventricular. Este resultado é consistente com a observação anterior de que o músculo regenerado nos corações amputados deriva principalmente de uma subpopulação de miócitos na parede lateral do ventrículo, na qual o factor de transcrição cardiogénica gata4 é activado (Kikuchi et al.., 2010).
Mais recentemente, o mesmo grupo realizou análises clonais multicoloridas semelhantes em células musculares corticais gata4+ e cmlc2+ com etiquetagem induzida na fase adulta, e estas experiências revelaram que, ao contrário da morfogénese ventricular inicial, não existe dominância clonal em células musculares corticais durante a regeneração (Gupta et al., 2013), sugerindo que o mecanismo de proliferação utilizado pelos cardiomiócitos durante a regeneração é distinto do utilizado durante o desenvolvimento cardíaco.