Reacção em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular relativamente simples e amplamente utilizada para amplificar e detectar sequências de ADN e RNA. Em comparação com os métodos tradicionais de clonagem e amplificação de ADN, que muitas vezes podem demorar dias, a PCR requer apenas algumas horas. A PCR é altamente sensível e requer um modelo mínimo para a detecção e amplificação de sequências específicas. Os métodos básicos de PCR avançaram ainda mais em relação à detecção simples de ADN e RNA. Abaixo, fornecemos uma visão geral dos diferentes métodos de PCR e dos reagentes que fornecemos na Enzo Life Sciences para as suas necessidades de investigação. O nosso objectivo é ajudar os cientistas a aceder rapidamente aos reagentes de PCR para utilizar no seu próximo projecto de investigação!
PCR
Para a PCR padrão, tudo o que precisa é de uma polimerase de ADN, magnésio, nucleótidos, primários, o modelo de ADN a ser amplificado e um termociclador. O mecanismo de PCR é tão simples como a sua finalidade: 1) o ADN de cadeia dupla (dsDNA) é desnaturado por calor, 2) os iniciadores alinham-se com as cadeias de ADN simples e 3) os iniciadores são estendidos pela DNA polimerase, resultando em duas cópias da cadeia de ADN original. O processo de desnaturação, recozimento e alongamento ao longo de uma série de temperaturas e tempos é conhecido como um ciclo de amplificação. Cada etapa do ciclo deve ser optimizada para o modelo e conjunto de iniciadores utilizados. Este ciclo é repetido aproximadamente 20-40 vezes e o produto amplificado pode então ser analisado. A PCR é amplamente utilizada para amplificar o ADN para posterior utilização experimental. A PCR também tem aplicações em testes genéticos ou para a detecção de ADN patogénico.
Como a PCR é um método altamente sensível e são necessários volumes muito pequenos para reacções únicas, recomenda-se a preparação de uma mistura principal para várias reacções. A master mix deve ser bem misturada e depois dividida pelo número de reacções, assegurando que cada reacção conterá a mesma quantidade de enzima, dNTPs e primários. Muitos fornecedores, como a Enzo Life Sciences, também oferecem misturas de PCR que já contêm tudo excepto primários e o modelo de ADN.
Regiões ricas em guanina/citosina (ricas em GC) representam um desafio nas técnicas de PCR padrão. As sequências ricas em GC são mais estáveis do que as sequências com menor conteúdo de GC. Além disso, as sequências ricas em GC tendem a formar estruturas secundárias, tais como laços de gancho de cabelo. Como resultado, os fios duplos ricos em GC são difíceis de separar completamente durante a fase de desnaturação. Consequentemente, a DNA polimerase não pode sintetizar o novo cordão sem obstáculos. Uma temperatura de desnaturação mais elevada pode melhorar isto e ajustes no sentido de uma temperatura de recozimento mais elevada e um tempo de recozimento mais curto podem impedir a ligação não específica de primários ricos em GC. Reagentes adicionais podem melhorar a amplificação das sequências ricas em GC. DMSO, glicerol e betaína ajudam a perturbar as estruturas secundárias que são causadas pelas interacções de GC e assim facilitam a separação dos fios duplos.
Alglgarantia de início quente
A amplificação inespecífica é um problema que pode ocorrer durante a PCR. A maioria das polimerases de ADN que são utilizadas para PCR, funcionam melhor a 68 – 72°C. Por conseguinte, a temperatura de extensão escolhida deve situar-se nesta gama. A enzima também pode, no entanto, estar activa em menor grau, a temperaturas mais baixas. A temperaturas muito abaixo da temperatura de recozimento, os primários tendem a ligar-se de forma não específica, o que pode levar a uma amplificação não específica, mesmo que a reacção seja colocada em gelo. Isto pode ser evitado utilizando inibidores da polimerase que se dissociam da polimerase do ADN apenas quando se atinge uma determinada temperatura. O inibidor pode ser um anticorpo que liga a polimerase e desnaturaliza à temperatura inicial de desnaturação.
RT-PCR
A transcrição reversa PCR, ou RT-PCR, permite o uso de RNA como modelo. Uma etapa adicional permite a detecção e amplificação do RNA. O RNA é transcrito em ADN complementar (cDNA), utilizando a transcriptase inversa. A qualidade e pureza do modelo de RNA é essencial para o sucesso da RT-PCR. O primeiro passo da RT-PCR é a síntese de um híbrido ADN/RNA. A transcriptase reversa também tem uma função RNase H, que degrada a porção de RNA do híbrido. A molécula de ADN isolada é então completada pela actividade de DNA polimerase dependente do ADN da transcriptase reversa em cDNA. A eficiência da reacção de primeira cadeia pode afectar o processo de amplificação. A partir daqui, o procedimento padrão de PCR é utilizado para amplificar o cDNA. A possibilidade de reverter o RNA em cDNA por RT-PCR tem muitas vantagens. O RNA é de uma só corda e muito instável, o que torna difícil trabalhar com ele. Mais frequentemente, serve como um primeiro passo em qPCR, que quantifica as transcrições de RNA numa amostra biológica.
h2>qPCR e RT-qPCRQuantitative PCR (qPCR) é utilizado para detectar, caracterizar e quantificar ácidos nucleicos para numerosas aplicações. Normalmente, em RT-qPCR, as transcrições de RNA são quantificadas por transcrição inversa em cDNA primeiro, como descrito acima, e depois qPCR é posteriormente realizado. Tal como na PCR padrão, o ADN é amplificado por 3 passos repetidos: desnaturação, recozimento e alongamento. No entanto, em qPCR, a etiquetagem fluorescente permite a recolha de dados à medida que a PCR progride. Esta técnica tem muitos benefícios devido a uma gama de métodos e químicas disponíveis.
Em qPCR (tipicamente verde), a etiquetagem fluorescente permite a quantificação das moléculas de ADN amplificadas, empregando o uso de um corante de ligação dsDNA. Durante cada ciclo, a fluorescência é medida. O sinal de fluorescência aumenta proporcionalmente à quantidade de ADN replicado e, portanto, o ADN é quantificado em “tempo real”. As desvantagens do qPCR baseado em corantes são que apenas um alvo pode ser examinado de cada vez e que o corante se ligará a qualquer ds-DNA presente na amostra.
Em qPCR baseado em sonda, muitos alvos podem ser detectados simultaneamente em cada amostra, mas isto requer a optimização e concepção de uma sonda(s) específica(s) do alvo, utilizada(s) para além dos primários. Há vários tipos de desenhos de sondas disponíveis, mas o tipo mais comum é uma sonda de hidrólise, que incorpora a utilização de um fluoróforo e um supressor. A transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) evita a emissão do fluoróforo através do supressor enquanto a sonda está intacta. No entanto, durante a reacção PCR, a sonda é hidrolisada durante a extensão e amplificação da sequência específica a que está ligada. A clivagem da sonda separa o fluoróforo do supressor e resulta num aumento da fluorescência dependente da amplificação. Assim, o sinal de fluorescência de uma reacção qPCR baseada na sonda é proporcional à quantidade da sequência alvo da sonda presente na amostra. Como o qPCR baseado em sondas é mais específico do que o qPCR baseado em corantes, é frequentemente a tecnologia utilizada nos ensaios de diagnóstico qPCR.
Outros detalhes podem ser encontrados no nosso website: AMPIGENE® PCR & Soluções qPCR. A missão da Enzo é fornecer soluções de baixo custo, facilmente adaptáveis e eficazes para o mercado de diagnóstico. A nossa plataforma AMPIPROBE® utiliza uma nova concepção de PCR para permitir a quantificação de ácidos nucleicos para alvos clinicamente relevantes. Os nossos ensaios são facilmente adaptáveis para uso laboratorial e rentáveis, sem comprometer a qualidade e o desempenho. Compatíveis em plataformas abertas de PCR, os ensaios AMPIPROBE® podem ser validados na instrumentação existente, eliminando a necessidade de despesas de capital.
O quadro resumo abaixo destaca os produtos de PCR disponíveis para PCR, RT-PCR e qPCR. Favor clicar no produto de interesse para mais informações ou contactar a nossa Equipa de Apoio Técnico para mais assistência.
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