Uso de Biomarcadores
Porque os organismos bentónicos estão expostos a múltiplos factores de stress e nem sempre é possível testar a presença de contaminantes particulares nos tecidos, tem havido uma pesquisa de indicadores que demonstram a toxicidade dos contaminantes. Os biomarcadores costumavam ser definidos como respostas celulares ou bioquímicas a factores de stress ambiental, mas esta definição foi agora alargada para incluir respostas fisiológicas, químicas, genotóxicas, moleculares ou comportamentais (Scott e Sloman, 2004; Monserrat et al., 2007). Os biomarcadores estão actualmente a ser utilizados para avaliar o estado das águas costeiras europeias (Hagger et al., 2009).
Embora os biomarcadores tenham sido classificados de várias formas diferentes, agrupam-se em tipos específicos ou não específicos. Exemplos de biomarcadores específicos incluem o MT, que representa concentrações de metais vestigiais no tecido corporal, e a actividade da colinesterase, que foi proposta como biomarcador específico para organofosforados, pesticidas carbomatos, e neurotoxinas (Monserrat et al., 2007). Alternativamente, existem biomarcadores não específicos tais como danos no ADN, oxidação de proteínas, e respostas antioxidantes, que reflectem combinações de factores de stress (Geracitano et al., 2004). Os biomarcadores dos danos no ADN são ferramentas valiosas para avaliar os efeitos da exposição aguda e crónica de animais aquáticos a substâncias genotóxicas (Amado et al., 2006). Quaisquer alterações positivas ou negativas são importantes porque podem ser transmitidas às gerações futuras e têm consequências ecológicas.
A investigação dos biomarcadores nos últimos 10 anos tem sido extensa e, embora se tenha centrado nos mexilhões e peixes (van der Oost et al., 2003), houve também estudos sobre moluscos, ostras, amêijoas, vieiras, poliquetas, e crustáceos. Para os mexilhões, foi testada uma vasta gama de biomarcadores na Europa. Mariogomez et al. (2013) avaliaram recentemente cinco sistemas de biomarcadores, incluindo uma resposta integrada de biomarcadores (IBR) utilizando biomarcadores bioquímicos, histoquímicos e histológicos de efeito. Utilizando um conjunto de dados a longo prazo de mexilhões recolhidos como parte de um programa de monitorização de vigilância de mexilhões após o derrame de petróleo do Prestige, investigaram que biomarcadores eram sensíveis ao stress ambiental. Concluíram também que, embora os índices diferissem em termos de sensibilidade e resultados, todos foram úteis para simplificar a interpretação dos efeitos biológicos da poluição. Concluíram, contudo, que para que estes fossem eficazes, era necessário compreender os mecanismos subjacentes às respostas ao stress. Também é necessário compreender se há mudanças sazonais nas respostas dos biomarcadores e alguns índices aparecem mais poderosos quando o número de biomarcadores utilizados aumenta. Finalmente, é necessário conhecer os níveis de fundo e os valores de base para as áreas em estudo. Um dos melhores biomarcadores para a exposição a metais é a carga de metais nos tecidos, que varia de acordo com o tecido específico testado. Além disso, as MTs são proteínas de baixo peso molecular, que regulam os níveis de metais essenciais lábeis, tais como Zn e Cu, nas células e reduzem os efeitos nocivos das espécies reactivas de oxigénio. Alguns cientistas questionam a especificidade das MT, afirmando que são produzidas em resposta a outros factores de stress e em estudos mais antigos foi encontrada pouca correlação entre a indução de MT e a exposição a metais (Chapman et al., 2003). A expressão desta proteína é também induzida por hipoxia, sinais endócrinos e stress oxidativo e é também afectada pelo desenvolvimento das gónadas e pela disponibilidade alimentar. A capacidade de sintetizar o MT difere entre os moluscos marinhos em alguns dos níveis de aumento nas regiões onde as concentrações são mais elevadas. Os níveis na vieira, A. gibbus, foram mais elevados nas brânquias das vieiras contaminadas por esgotos municipais (Quinn et al., 2005).
Para examinar os efeitos da exposição ao metal nas vieiras, Regoli et al. (1998) mediram respostas lisossómicas e anti-oxidantes na glândula digestiva da vieira do Antárctico após a exposição ao cobre e ao mercúrio. Mais recentemente, Liu et al. (2012) recolheram amostras de C. farreri de locais que diferiam em contaminantes. A água e os tecidos da vieira (brânquias e glândulas digestivas) foram testados quanto a vestígios de metais (Cu, Cd, Pb, e Zn) e 16 PAH. Também foram medidos GST (glutathione-S-transferase), quebra de cadeias de ADN, conteúdo proteico, e peroxidação lipídica. A GST foi inibida e a aril-hidroxilase (responsável pela etapa oxidativa inicial no metabolismo de uma variedade de PAH) foi elevada num local onde os níveis de PAH eram elevados. Para Argopecten purpuratus, Zapata et al. (2012) também mediram concentrações de metais para Cu, Cd, e Pb nas guelras e na glândula digestiva, três genes envolvidos no stress e metabolismo oxidativo (GPx, GST, e HSP70) e um marcador de proteínas (MT). Um conjunto de biomarcadores aumenta o potencial para distinguir locais com diferentes níveis de contaminantes. Verificaram que os genes de choque térmico foram induzidos; isto foi encontrado para outros bivalves expostos a metais vestigiais como o Hg e pode reflectir danos celulares que também ocorrem com temperaturas crescentes.
Utilizando uma combinação de factores de stress, Nahrgang et al. (2013) mediram níveis de base de metais e PAH em mexilhões e na vieira islandesa, Chlamys islandica, sazonalmente em 2010. Mediram uma boa gama de biomarcadores, incluindo a estabilidade da membrana lisossomal em hemócitos, reservas energéticas nas glândulas digestivas, e stress oxidativo e enzimas antioxidantes (GST, CAT, e GPX), e peroxidação lipídica (TBARS – substâncias reactivas de tibarbitúria), juntamente com a capacidade total de absorção oxidativa (TOSC). Verificaram que alguns dos níveis de biomarcadores variavam sazonalmente, talvez em resposta ao aumento de nutrientes e temperaturas mais elevadas, e concluíram que as medidas conjuntas de TBARS e TOSC proporcionavam uma melhor medida do stress oxidativo durante o ano do que as medidas de CAT, GPX, e GST. Esta investigação proporciona agora uma plataforma para mais estudos em áreas de exposição conhecida a traços metálicos elevados ou outros contaminantes. É, contudo, importante compreender a variabilidade natural e como os poluentes afectam os biomarcadores e se interagem de forma sinérgica ou antagónica.
Biomarcadores de stress oxidativo são úteis porque podem fornecer alguns dos primeiros sinais de stress aos organismos (Regoli et al., 2000; Valko et al., 2005; Valavanidis et al., 2006). Os biomarcadores normalmente utilizados tanto em peixes como em mexilhões incluem catalase (CAT), glutatião peroxidase (GPX), e peroxidação lipídica, juntamente com o TOSC. Camus et al. (2002) injectaram a vieira islandesa com duas concentrações de benzo(a) pireno (BaP)-PAH no músculo adutor durante 4 dias e amostraram a hemolinfa dos tecidos do músculo adutor e do hepatopâncreas. A presença de antioxidantes deprimiu a actividade da TOSC, demonstrando um efeito contaminante. Em trabalhos mais recentes, Pan et al. (2009) mediram as respostas do biomarcador antioxidante de pequenos Chlamys farreri ao mesmo HAP, utilizando tecidos tanto da brânquia como da glândula digestiva. Foi encontrada uma relação dose-resposta fiável entre BaP e 7-ethoxyresorufin-O-deethylase na actividade da glândula digestiva e GST, SOD, CAT, GPx, e LPO propostos como instrumentos para uso em estudos de stress e toxicidade. Hannam et al. (2010) encontraram provas de stress oxidativo e respostas imunotóxicas na vieira islandesa Chlamys islandica após exposição a níveis de PAH de 163 µg L-1 durante um período de 21 dias. Após a cessação da exposição, não houve recuperação da função imunológica, sugerindo que havia potencial para a continuação dos efeitos sub-letais a longo prazo.
Cholinesterases (ChE) e AChE são hidrolases serinas que desempenham um papel na neurotransmissão e são as enzimas alvo dos pesticidas organofosforados (OP) e carbamatos (CB). Bocquene (1997) não encontrou evidência de inibição de AChE em extractos de músculos adutores que indicassem a presença de contaminantes insecticidas, mas Owen et al. (2002) reportaram inibição da actividade de AChE e BChE na hemolinfa da vieira tropical Euvola (Pecten) ziczac ao pesticida OP cloropirifos. Regoli et al. (1997, 1998) propuseram a utilização de respostas lisossómicas e antioxidantes em Adamussium colbecki como um instrumento de alerta precoce para detectar perturbações ambientais no ambiente antárctico. Também foram determinadas actividades de EC para outros substratos em tecidos da vieira do Antárctico A. colbecki (Bonacci et al., 2004; Corsi et al., 2004; Bonacci et al., 2008), que apresentavam respostas dose-dependentes de cloropirifos, tal como encontradas em outros bivalves. Enquanto o ChE tinha sido considerado como biomarcadores específicos para estes compostos, outros cientistas sugerem que poderiam ser afectados por uma série de contaminantes, incluindo HAP, metais vestigiais, e misturas complexas. Isto foi encontrado para extractos de corpo inteiro de duas espécies de mexilhão expostas a doses crescentes de Cd e Zn (Najimi et al., 1997). Bonacci et al. (2008) testaram as respostas de ChE de Pecten jacobaeus ao OP azametifos e diisopropilfluorofosfato, cádmio, e zinco utilizando tecidos das guelras, glândula digestiva, e músculo adutor. Encontraram respostas específicas dos tecidos e inibição dependente da dose de ChE em resposta à exposição in vitro ao cádmio e ao azameteifos, mas a sensibilidade ao zinco e ao DFC era menor. A susceptibilidade das guelras foi mais elevada dos três tecidos testados e destaca os efeitos dos danos porque estes são o local primário para a respiração e troca iónica. É importante testar os efeitos biomarcadores em outros contaminantes e em espécies de vieira das regiões temperadas, tropicais e polares. Bonacci et al. (2009) mediram as respostas de ChE da vieira da Antárctida, A. colbecki expostos a organofosforados e hidrocarbonetos policíclicos, PAH, e PCB. Os resultados para PAH e PCB sugeriram uma resposta de ChE, mas esta não foi dependente da dose e o PCB por si só não suscitou uma resposta. A falta de uma resposta de concentração-dose sugere que a actividade ChE pode não ser uma ferramenta sensível para medir misturas das substâncias químicas acima referidas no ambiente marinho.