Estudios de mapeo de destino
Identificar los orígenes celulares de los tejidos en regeneración es una cuestión fundamental en la biología de la regeneración. Varios estudios han realizado análisis de mapeo de destino para investigar el origen o los orígenes celulares del músculo cardíaco durante la regeneración del corazón en el pez cebra. Utilizando técnicas de mapeo de destino genético inducible (Buckingham y Meilhac, 2011), dos estudios examinaron directamente la contribución de los cardiomiocitos al corazón regenerado del pez cebra (Jopling et al., 2010; Kikuchi et al., 2010). En ambos casos, se utilizaron dos líneas transgénicas: una línea porta un gen Cre recombinasa inducible por 4-hidroxitamoxifeno (4-HT), cuya expresión es impulsada en los cardiomiocitos por el promotor del gen de la cadena ligera de miosina cardíaca 2 (cmlc2), también conocido como gen de la cadena ligera de miosina 7 (myl7); y la otra es una línea indicadora en la que la expresión del reportero de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) puede ser inducida en las células que expresan CreER tras la escisión del casete de parada transcripcional flanqueado por loxP mediante tratamientos con 4-HT (Jopling et al., 2010; Kikuchi et al., 2010). Utilizando este sistema, casi todos los cardiomiocitos que expresan cmlc2 fueron preetiquetados con EGFP mediante tratamientos con 4-HT antes de la lesión, y se realizaron experimentos de regeneración 30 días después de la resección ventricular. Los resultados de ambos estudios mostraron claramente que la gran mayoría del miocardio regenerado está etiquetado con EGFP, sin que se detectaran diferencias significativas en la proporción de cardiomiocitos EGFP+ en el tejido regenerado en comparación con los ventrículos no lesionados, lo que indica que los cardiomiocitos cmlc2+ existentes, pero no los no-miocitos cmlc2-, son la principal fuente de nuevo músculo durante la regeneración del corazón del pez cebra.
Se ha demostrado previamente que las células derivadas del epicardio (EPDCs) contribuyen y regulan la vascularización durante la regeneración cardíaca en el pez cebra (Kim et al, 2010; Lepilina et al., 2006); sin embargo, su contribución a la regeneración del miocardio no ha sido probada directamente. Estudios recientes han abordado esta cuestión utilizando dos enfoques diferentes: el mapeo genético del destino (Kikuchi et al., 2011a) y el trasplante (González-Rosa et al., 2012). En el estudio de mapeo genético inducible del destino, las secuencias cis-reguladoras del factor de transcripción 21 (tcf21), también conocido como Epicardina (Robb et al., 1998), Pod1 (Quaggin et al., 1999), Capsulina (Hidai et al., 1998; Lu et al., 1998), se utilizaron para dirigir CreER al epicardio del pez cebra (Serluca, 2008), y su progenie se rastreó durante la regeneración tras el etiquetado dependiente de CreER con EGFP, que se indujo a partir de una línea indicadora con un tratamiento transitorio de 4-HT. En el ensayo de trasplante, se recogió un trozo de tejido cardíaco del ventrículo lesionado de la cepa β-actina:EGFP, en el que la mayoría de las células cardíacas, incluidas las células epicárdicas, estaban marcadas con EGFP, y se trasplantó a un corazón de tipo salvaje recién lesionado que había sido irradiado antes de la lesión para suprimir la proliferación de células en el tejido receptor. En ambos estudios, se detectaron muchas células marcadas con EGFP en el regenerado y se caracterizaron histológicamente como miofibroblastos (González-Rosa et al., 2012) y células perivasculares (González-Rosa et al., 2012; Kikuchi et al., 2011a), pero no como cardiomiocitos (González-Rosa et al., 2012; Kikuchi et al., 2011a). Estos resultados indican que el epicardio o las EPDC no dan lugar a músculo cardíaco durante la regeneración del corazón del pez cebra, lo que es coherente con el hallazgo de que los cardiomiocitos son la principal fuente de regeneración del miocardio.
Los experimentos de rastreo de linaje descritos anteriormente no abordaron si la población cmlc2+ incluye múltiples tipos de células musculares que pueden contribuir de manera diferente a la regeneración. Recientemente, Poss y sus colegas han generado un sistema transgénico que permite el etiquetado clonal multicolor de los cardiomiocitos, y definieron linajes miocárdicos no caracterizados previamente, al tiempo que revelaron sus comportamientos durante la morfogénesis del corazón del pez cebra (Gupta y Poss, 2012). Este sistema consistía en dos alelos transgénicos, cmlc2:CreER (Kikuchi et al., 2010) y un casete reportero multicolor denominado priZm, que se construyó utilizando la tecnología Brainbow desarrollada originalmente para visualizar neuronas individuales y conexiones en el cerebro del ratón (Livet et al., 2007) (Fig. 1A). Utilizando este sistema, los autores indujeron el etiquetado clonal multicolor a los 2 días después de la fecundación, y realizaron análisis de imágenes en varias etapas de desarrollo para caracterizar en detalle cómo se comportan los clones de cardiomiocitos durante la morfogénesis del corazón.
Figura 1. Nuevas fuentes celulares para el músculo cardíaco. (A) Un sistema transgénico para el etiquetado clonal multicolor de cardiomiocitos. El casete priZm expresa una proteína reportera fluorescente roja (RFP) como color por defecto bajo el control del promotor β-actina2. La recombinación diferencial entre los sitios emparejados lox2272 (triángulo negro) o loxP (triángulo blanco) induce la expresión de la proteína fluorescente cian (CFP) o la proteína fluorescente amarilla (YFP), respectivamente. La cepa transgénica priZm lleva inserciones multicopia en tándem del casete indicado en un único locus genético, y los eventos de escisión limitados mediados por Cre en los sitios loxP o lox2272 producen muchos colores permanentes posibles con varias combinaciones de expresión de RFP, CFP y YFP. Esta estrategia permite el etiquetado clonal multicolor de los cardiomiocitos en el contexto transgénico doble con la cepa cmlc2:CreER (Kikuchi et al., 2010) tras los tratamientos con tamoxifeno (Gupta y Poss, 2012). (B) Linajes musculares en el ventrículo del pez cebra. Tr, músculo trabecular; Pr, músculo primordial. (C) Regeneración de células musculares primordiales y corticales. Las flechas y las puntas de flecha de los paneles central y derecho indican el borde de los clones migratorios de la capa muscular primordial y la pared ventricular reparada por la capa muscular cortical, respectivamente. Línea de puntos: plano de amputación. La figura es un resumen del trabajo de Poss y sus colegas (Gupta y Poss, 2012).
Se ha reconocido que el ventrículo del pez cebra contiene dos tipos de músculo cardíaco, que comprende una pared periférica denominada capa compacta y una capa trabecular interna (Hu et al., 2001). Se ha demostrado que la formación de trabéculas se produce a través de la deslaminación de los cardiomiocitos del músculo de la pared ventricular (Liu et al., 2010). El enfoque de etiquetado clonal descrito anteriormente refinó esta comprensión anatómica y de desarrollo del corazón del pez cebra. En primer lugar, los autores descubrieron que la pared muscular externa del tubo cardíaco embrionario persiste incluso en el ventrículo adulto. Para acomodar el crecimiento cardíaco, esta capa muscular se expande sólo de forma circunferencial a lo largo de la vida del pez, manteniendo un grosor de un solo cardiomiocito como el visto en el corazón embrionario. Este linaje muscular, denominado músculo primordial, persiste para formar la capa más interna de la pared muscular periférica del ventrículo adulto (Fig. 1B, panel derecho). En segundo lugar, los autores observaron que en la etapa juvenil, la capa muscular primordial es penetrada por unos pocos clones de cardiomiocitos trabeculares – ~ 8 clones por ventrículo – como eventos raros y espacialmente segregados, y estos clones de cardiomiocitos dominantes crecen sobre toda la capa primordial, creando otra pared muscular que constituye la capa más externa de la pared muscular periférica del ventrículo adulto (Fig. 1B). Este linaje muscular es claramente distinto de los linajes muscular trabecular y primordial, y se ha denominado capa muscular cortical. Por lo tanto, en la visión refinada, el ventrículo del pez cebra adulto consta de tres linajes musculares diferentes, músculo primordial, trabecular y cortical, y estos linajes se desarrollan en esta secuencia temporal durante el desarrollo (Gupta y Poss, 2012).
Después de la definición de los linajes musculares distintos, una pregunta interesante que hay que plantearse es si estos linajes contribuyen diferencialmente a la regeneración del corazón. Los autores realizaron experimentos de regeneración utilizando ventrículos de peces adultos cmlc2:CreER; priZm en los que se había inducido el etiquetado clonal multicolor en una etapa embrionaria como se ha descrito anteriormente. A los 14 días después de la lesión, los clones de músculo cortical adyacentes a la herida se expandieron en dirección lateral y radial hacia el lugar de la lesión, pero la integración de las células musculares primordiales no se produjo en este punto temporal (Fig. 1C, panel central). A los 30 días de la lesión, a medida que el músculo cortical reconstruía la pared muscular, los clones de la capa muscular primordial se hacían detectables en el regenerado, y se restablecía una capa primordial completa, formando un límite de capa celular única entre el músculo trabecular y el cortical regenerado a los 60 días del traumatismo (Fig. 1C, panel derecho). Así pues, tanto las capas musculares primordiales como las corticales contribuyen al regenerado, pero se forman en orden inverso a la secuencia del desarrollo normal. El músculo primordial se expande sólo de forma circunferencial, como se observa durante la morfogénesis cardíaca, mientras que el músculo cortical se expande de forma menos restringida y contribuye con la mayor masa de la nueva pared ventricular. Este resultado es coherente con la observación previa de que el músculo regenerado en corazones amputados deriva principalmente de una subpoblación de miocitos en la pared lateral del ventrículo en la que se activa el factor de transcripción cardiogénico gata4 (Kikuchi et al, 2010).
Más recientemente, el mismo grupo ha realizado análisis clonales multicolor similares en células musculares corticales gata4+ y cmlc2+ con etiquetado inducido en la etapa adulta, y estos experimentos revelaron que, a diferencia de la morfogénesis ventricular inicial, no hay predominio clonal en las células musculares corticales durante la regeneración (Gupta et al., 2013), lo que sugiere que el mecanismo de proliferación utilizado por los cardiomiocitos durante la regeneración es distinto del utilizado durante el desarrollo cardíaco.