En 2005, il commence à se produire régulièrement au Comedy Store de West Hollywood, en Californie. Maniscalco cite Jerry Seinfeld, George Carlin, Brian Regan, John Ritter, Johnny Carson, Andrew Dice Clay, Bill Burr et Don Rickles comme influences comiques. Depuis, il a fait une demi-heure pour Comedy Central Presents et cinq émissions spéciales d’une heure. Sa première émission spéciale, Sebastian Live, est sortie le 2 juin 2009. Ses trois émissions spéciales suivantes ont été diffusées sur Showtime, avec What’s Wrong with People ? sorti le 5 janvier 2012, Aren’t You Embarrassed ? enregistré à Chicago, sorti le 14 novembre 2014, et Why Would You Do That ? enregistré à New York et sorti en 2016.
Maniscalco a été l’un des quatre humoristes présentés dans le Wild West Comedy Show de Vince Vaughn : 30 jours & 30 nuits – Hollywood to the Heartland, aux côtés d’Ahmed Ahmed, John Caparulo et Bret Ernst. Maniscalco a participé aux émissions Best Night Ever de Russell Peters, Comedy Central Presents, The Late Late Show with Craig Ferguson, The Tonight Show with Jay Leno, The Jay Leno Show, The Tonight Show Starring Jimmy Fallon, Conan, et The Late Show with Stephen Colbert. En outre, il est apparu dans plusieurs films, tels que The Nut Job 2 : Nutty by Nature, The House, Tag, et Cruise, et il a un podcast intitulé The Pete and Sebastian Show avec son collègue humoriste Pete Correale. Depuis janvier 2017, ils ont une émission sur la chaîne 99 Raw Dog Comedy de la radio satellite Sirius XM. En 2016, Maniscalco est apparu dans la septième saison de Comedians in Cars Getting Coffee. Il a publié ses mémoires Stay Hungry le 27 février 2018. Un spécial Netflix également intitulé Stay Hungry est sorti le 15 janvier 2019.
En 2018, Maniscalco a fait ses débuts au cinéma, dans le rôle de Johnny Venere dans le film Green Book, récompensé par un Oscar. Maniscalco a animé les MTV Video Music Awards 2019 le 26 août. En novembre 2019, Maniscalco est apparu dans The Irishman de Martin Scorsese en jouant le rôle de « Crazy » Joe Gallo aux côtés de Robert De Niro, Joe Pesci et Al Pacino. Il a également animé le podcast d’accompagnement du film en trois parties, publié pour la première fois le 2 décembre 2019 et intitulé Behind the Irishman.