La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular relativamente sencilla y ampliamente utilizada para amplificar y detectar secuencias de ADN y ARN. En comparación con los métodos tradicionales de clonación y amplificación de ADN, que a menudo pueden tardar días, la PCR sólo requiere unas horas. La PCR es muy sensible y requiere una plantilla mínima para la detección y amplificación de secuencias específicas. Los métodos básicos de la PCR han avanzado más allá de la simple detección de ADN y ARN. A continuación, hemos proporcionado una visión general de los diferentes métodos de PCR y los reactivos que proporcionamos en Enzo Life Sciences para sus necesidades de investigación. Nuestro objetivo es ayudar a los científicos a acceder rápidamente a los reactivos de PCR para utilizarlos en su próximo proyecto de investigación
PCR
Para la PCR estándar, todo lo que necesita es una polimerasa de ADN, magnesio, nucleótidos, cebadores, la plantilla de ADN a amplificar y un termociclador. El mecanismo de la PCR es tan sencillo como su finalidad: 1) el ADN de doble cadena (ADNd) se desnaturaliza con calor, 2) los cebadores se alinean con las cadenas de ADN simples y 3) los cebadores son extendidos por la ADN polimerasa, dando lugar a dos copias de la cadena de ADN original. El proceso de desnaturalización, recocido y elongación a lo largo de una serie de temperaturas y tiempos se conoce como un ciclo de amplificación. Cada paso del ciclo debe optimizarse para la plantilla y el conjunto de cebadores utilizados. Este ciclo se repite aproximadamente 20-40 veces y el producto amplificado puede ser analizado. La PCR se utiliza ampliamente para amplificar el ADN para su posterior uso experimental. La PCR también tiene aplicaciones en pruebas genéticas o para la detección de ADN patógeno.
Como la PCR es un método muy sensible y se requieren volúmenes muy pequeños para reacciones individuales, se recomienda la preparación de una mezcla maestra para varias reacciones. La mezcla maestra debe mezclarse bien y luego dividirse por el número de reacciones, asegurando que cada reacción contenga la misma cantidad de enzima, dNTPs y cebadores. Muchos proveedores, como Enzo Life Sciences, también ofrecen mezclas de PCR que ya contienen todo excepto los cebadores y la plantilla de ADN.
Las regiones ricas en guanina/citosina (GC) representan un reto en las técnicas de PCR estándar. Las secuencias ricas en GC son más estables que las secuencias con menor contenido de GC. Además, las secuencias ricas en GC tienden a formar estructuras secundarias, como bucles de horquilla. Como resultado, las dobles cadenas ricas en GC son difíciles de separar completamente durante la fase de desnaturalización. En consecuencia, la ADN polimerasa no puede sintetizar la nueva hebra sin obstáculos. Una temperatura de desnaturalización más alta puede mejorar esto y los ajustes hacia una temperatura de recocido más alta y un tiempo de recocido más corto pueden evitar la unión inespecífica de los cebadores ricos en GC. Los reactivos adicionales pueden mejorar la amplificación de las secuencias ricas en GC. El DMSO, el glicerol y la betaína contribuyen a perturbar las estructuras secundarias causadas por las interacciones de los GC y, por lo tanto, facilitan la separación de las cadenas dobles.
PCR de arranque en caliente
La amplificación inespecífica es un problema que puede ocurrir durante la PCR. La mayoría de las ADN polimerasas que se utilizan para la PCR, funcionan mejor a 68 – 72°C. Por lo tanto, la temperatura de extensión elegida debe estar en este rango. Sin embargo, la enzima también puede ser activa, en menor grado, a temperaturas más bajas. A temperaturas muy inferiores a la temperatura de recocido, los cebadores tienden a unirse de forma inespecífica, lo que puede dar lugar a una amplificación inespecífica, incluso si la reacción se prepara en hielo. Esto puede evitarse utilizando inhibidores de la polimerasa que se disocian de la ADN polimerasa sólo cuando se alcanza una determinada temperatura. El inhibidor puede ser un anticuerpo que se une a la polimerasa y se desnaturaliza a la temperatura de desnaturalización inicial.
RT-PCR
La PCR de transcripción inversa, o RT-PCR, permite utilizar el ARN como molde. Un paso adicional permite la detección y amplificación del ARN. El ARN se transcribe de forma inversa en ADN complementario (ADNc), utilizando la transcriptasa inversa. La calidad y la pureza de la plantilla de ARN es esencial para el éxito de la RT-PCR. El primer paso de la RT-PCR es la síntesis de un híbrido de ADN/ARN. La transcriptasa inversa también tiene una función de RNasa H, que degrada la porción de ARN del híbrido. A continuación, la molécula de ADN monocatenario es completada por la actividad ADN polimerasa dependiente de la transcriptasa inversa en ADNc. La eficacia de la reacción de la primera cadena puede afectar al proceso de amplificación. A partir de aquí, se utiliza el procedimiento estándar de PCR para amplificar el ADNc. La posibilidad de convertir el ARN en ADNc mediante la RT-PCR tiene muchas ventajas. El ARN es monocatenario y muy inestable, lo que dificulta el trabajo con él. Lo más habitual es que sirva como primer paso en la qPCR, que cuantifica los transcritos de ARN en una muestra biológica.
qPCR y RT-qPCR
La PCR cuantitativa (qPCR) se utiliza para detectar, caracterizar y cuantificar ácidos nucleicos para numerosas aplicaciones. Comúnmente, en la RT-qPCR, los transcritos de ARN se cuantifican transcribiéndolos primero en ADNc, como se ha descrito anteriormente, y luego se lleva a cabo la qPCR. Al igual que en la PCR estándar, el ADN se amplifica mediante tres pasos repetidos: desnaturalización, recocido y elongación. Sin embargo, en la qPCR, el etiquetado fluorescente permite recoger datos a medida que avanza la PCR. Esta técnica tiene muchas ventajas debido a la variedad de métodos y químicas disponibles.
En la qPCR basada en colorantes (típicamente verde), el etiquetado fluorescente permite la cuantificación de las moléculas de ADN amplificadas mediante el uso de un colorante de unión al ADNd. Durante cada ciclo, se mide la fluorescencia. La señal de fluorescencia aumenta proporcionalmente a la cantidad de ADN replicado y, por tanto, el ADN se cuantifica en «tiempo real». Las desventajas de la qPCR basada en el colorante son que sólo puede examinarse una diana a la vez y que el colorante se unirá a cualquier ADN-ds presente en la muestra.
En la qPCR basada en la sonda, pueden detectarse muchas dianas simultáneamente en cada muestra, pero esto requiere la optimización y el diseño de una(s) sonda(s) específica(s) de la diana, utilizada(s) además de los cebadores. Hay varios tipos de diseños de sondas disponibles, pero el tipo más común es una sonda de hidrólisis, que incorpora el uso de un fluoróforo y un quencher. La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) impide la emisión del fluoróforo a través del quencher mientras la sonda está intacta. Sin embargo, durante la reacción de PCR, la sonda se hidroliza durante la extensión del cebador y la amplificación de la secuencia específica a la que está unida. La escisión de la sonda separa el fluoróforo del quencher y da lugar a un aumento de la fluorescencia dependiente de la amplificación. Así, la señal de fluorescencia de una reacción de qPCR basada en la sonda es proporcional a la cantidad de la secuencia diana de la sonda presente en la muestra. Dado que la qPCR basada en sonda es más específica que la qPCR basada en colorante, suele ser la tecnología utilizada en los ensayos de diagnóstico de qPCR.
Puede encontrar más detalles en nuestro sitio web: AMPIGENE® PCR & Soluciones qPCR. La misión de Enzo es proporcionar soluciones de bajo coste, fácilmente adaptables y eficaces al mercado del diagnóstico. Nuestra plataforma AMPIPROBE® utiliza un novedoso diseño de PCR para permitir la cuantificación de ácidos nucleicos para objetivos clínicamente relevantes. Nuestros ensayos son fácilmente adaptables para su uso en el laboratorio y rentables, sin comprometer la calidad y el rendimiento. Compatibles con las plataformas de PCR abiertas, los ensayos AMPIPROBE® pueden validarse en la instrumentación existente, eliminando la necesidad de gastos de capital.
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