Uso in vitro de ocho agentes quimioterapéuticos
Las células DT40 isogénicas de tipo salvaje derivadas de un único clon celular fueron tratadas con ocho agentes citotóxicos diferentes de uso común que representan cada una de las principales clases de quimioterapéuticos contra el cáncer. Los agentes se enumeran en la Tabla 1. Para seleccionar una concentración de tratamiento, medimos la sensibilidad de las células DT40 a cada fármaco mediante un ensayo de supervivencia clonogénica (Fig. 1a). Elegimos condiciones de tratamiento cercanas a la concentración IC50 de cada fármaco que inducen sólo una muerte celular moderada, con un 30-85 % de las células que sobreviven, para evitar la selección de clones resistentes que podrían comportarse de forma diferente durante las siguientes rondas de tratamiento debido a posibles cambios en, por ejemplo, el transporte del fármaco o la reparación del ADN. Para las células supervivientes, los tratamientos se repitieron una vez a la semana durante cuatro ciclos, imitando los regímenes de quimioterapia contra el cáncer y aumentando la posibilidad de inducir mutaciones (Fig. 1b). Una comparación de la sensibilidad al cisplatino de varios clones posteriores al tratamiento con el clon inicial muestra que este régimen de tratamiento moderado no causó una selección significativa para la resistencia (Fig. 1c).
Tratamientos citotóxicos. a Ensayo de supervivencia de colonias de células DT40 tratadas con los fármacos citotóxicos indicados durante 1 h (cisplatino, ciclofosfamida) o 24 h. La concentración elegida para los ensayos de mutagénesis se indica con flechas negras. b Un dibujo esquemático del ensayo de mutagénesis. Se secuenció el ADN genómico del clon celular inicial previo al tratamiento y de tres clones celulares posteriores al tratamiento. c Comparación de la sensibilidad al cisplatino del clon inicial (negro) y de los clones aislados tras cuatro rondas de tratamiento con cisplatino (rojo). Se muestra la media y el SEM de tres mediciones
Uno de los fármacos probados, la ciclofosfamida, sufre una activación por hidroxilación por parte de las enzimas del citocromo P450 . Aunque se cree que esto tiene lugar principalmente en el hígado durante el tratamiento terapéutico, se ha demostrado que los linfocitos también expresan las enzimas necesarias para la activación de la ciclofosfamida . Por lo tanto, debido a la inestabilidad y a la limitada disponibilidad del metabolito activo 4-hidroxiciclofosfamida, la ciclofosfamida se añadió a las células en su forma de profármaco. El cisplatino y la ciclofosfamida, los dos fármacos que se sabe que forman aductos de ADN, se añadieron durante 1 hora con el razonamiento de que su efecto dañino para el ADN debería ser en gran medida independiente de la fase del ciclo celular. Los demás fármacos se utilizaron en tratamientos de 24 horas. Esta duración es el doble de la duración del ciclo celular de la DT40, lo que garantiza que cada célula se vería afectada por el tratamiento independientemente de la fase del ciclo celular en la que los fármacos ejercen su efecto principal.
Se identificaron mutaciones de un solo nucleótido (SNV) y mutaciones cortas de inserción/deleción en tres clones celulares derivados de cada tratamiento utilizando el método IsoMut desarrollado para este fin . Este método proporciona información sobre mutaciones en los genomas de tres células individuales que pasaron por el régimen de tratamiento (Fig. 1b). Brevemente, comparamos todas las secuencias del genoma completo obtenidas en este estudio en cada posición genómica, y sólo aceptamos una mutación si estaba presente en exactamente una muestra, satisfaciendo los criterios de frecuencia mínima del alelo mutado, la cobertura de la muestra mutada y la frecuencia mínima del alelo de referencia de cada otra muestra. Debido a la falta de disponibilidad de conjuntos de datos validados de SNP y mutaciones cortas de inserción o deleción (indel), este método de detección de mutaciones funciona mucho mejor en el genoma del pollo que otros métodos comúnmente utilizados, identificando el 90-95 % de todas las mutaciones con no más de 0-5 SNVs falsos positivos por genoma .
Mutaciones espontáneas
Siguiendo un régimen de tratamiento simulado que abarca aproximadamente 100 generaciones de células, detectamos 47 ± 20 (SD) SNVs nuevos en tres clones post-tratamiento (Tabla 2, Archivo adicional 1: Tabla S1). Es probable que casi todas las mutaciones identificadas hayan surgido realmente durante el tratamiento simulado, ya que se identificaron como mutaciones únicas entre todas las secuencias del genoma completo obtenidas para este estudio, y el mismo método de detección de mutaciones no encontró ninguna SNV única -que serían falsos positivos- en el clon inicial previo al tratamiento (Tabla 2). De las seis posibles sustituciones de bases (C > A, C > G, C > T, T > A, T > C, T > G), las transiciones C > T y las transversiones C > A fueron las más comunes entre las mutaciones espontáneas (Fig. 2c, d). El número de mutaciones observado, proyectado al genoma diploide de 2,06 × 109 pares de bases, equivale a unas 2,3 × 10-10 mutaciones por base y por división celular. Cuando las mutaciones se ven en el contexto de las bases vecinas, y el ‘espectro de mutaciones de tripletes’ espontáneo se normaliza a la frecuencia de aparición genómica de cada triplete, se hace evidente que las mutaciones NCG > NTG son más comunes, presumiblemente debido a las sustituciones de bases C > T en secuencias CpG metiladas . Calculamos que las mutaciones NCG > NTG eran 15× más comunes que la tasa media de mutación. Los espectros de tripletes no normalizados se muestran en el archivo adicional 2: Figura S1.
Número y espectro de SNVs inducidos por el tratamiento. a El número medio de SNVs observados por genoma tras el régimen de tratamiento descrito con los fármacos indicados. Las barras de error indican el SEM. b Espectro de sustitución de bases de las mutaciones que surgieron del tratamiento simulado, así como de los tratamientos con cisplatino y ciclofosfamida. c Número medio de mutaciones por muestra y espectro de sustitución de bases de los tratamientos indicados. Las diferencias significativas con respecto al tratamiento de prueba (p <0,05, prueba t de Student) se indican con un asterisco. d Espectros de mutación de tripletes de los tratamientos de prueba, cisplatino y ciclofosfamida. La base central de cada triplete, listada en la parte inferior, mutó como se indica en la parte superior del panel. El número de mutaciones de cada tipo se normalizó con respecto a la frecuencia de aparición de ese triplete de bases en el genoma del pollo, y se muestran las tasas de mutación resultantes
El cisplatino induce sustituciones de bases e indels cortos
El cisplatino indujo el mayor número de SNVs entre los ocho fármacos probados (Fig. 2a). Realizamos un análisis detallado de las mutaciones inducidas por el cisplatino para comprender mejor los mecanismos mutagénicos. Detectamos 812 ± 193 SNVs por clon secuenciado después del tratamiento. Las transversiones C/G > A/T fueron las más comunes, representando el 57 % de todas las SNVs, pero las seis clases de sustituciones de bases aumentaron al menos cuatro veces (Fig. 2b). Si se observan las SNVs inducidas por el cisplatino en el contexto de las bases vecinas, es evidente que las mutaciones NCC > NAC son las más comunes, representando el 40 % de todos los casos de SNV. Otras mutaciones comunes son NCT > NAT y NTC > NAC, que aparecen en el 12 % y el 9 % de los casos de SNV (Fig. 2d, archivo adicional 2: Figura S1 y Figura S3 y Archivo adicional 1: Tabla S2). Dado que la inmensa mayoría de las lesiones del ADN inducidas por el cisplatino son enlaces cruzados intrastrand entre purinas vecinas, estos tres tipos de SNV podrían representar mutaciones opuestas a la base 3′ de los dinucleótidos GG, AG y GA reticulados, respectivamente. En el caso de los entrecruzamientos GG y AG, estas mutaciones surgen por la incorporación incorrecta de una adenosina frente a la G 3′ de la lesión (Fig. 3c). Sin embargo, los entrecruzamientos GA no se han observado en los informes anteriores. Por lo tanto, catalogamos las bases que rodean las 211 mutaciones TC > AC (GA > GT) observadas y descubrimos que 159 incidencias ocurrían en las secuencias TCC > ACC o TCT > ACT, lo que sugiere que el par de bases adyacente 3′ a un entrecruzamiento GG o AG intrastrand puede también mutar. De las 52 mutaciones restantes, diez se produjeron en la base 5′ de potenciales enlaces cruzados AG en las secuencias CTC > CAC, pero en el resto de los casos el único sitio potencial para un enlace cruzado bipurínico es en GA (archivo adicional 2: Figura S2). Llegamos a la conclusión de que el cisplatino induce lesiones mutagénicas en los dinucleótidos GA, donde las lesiones pueden ser enlaces cruzados o monoaductos GA intrastrandos no observados hasta ahora. Para completar el análisis de las mutaciones de un solo nucleótido inducidas por cisplatino, observamos un enriquecimiento de CCA > CAA y CTN > CAN cambios de base, lo que sugiere una mala incorporación de adenosina frente a la base 5′ de dinucleótidos GG o AG entrecruzados.
Espacio entre mutaciones de SNV, mutaciones de dinucleótidos y mecanismos propuestos de mutaciones de mono y dinucleótidos. a La distancia de cada mutación de SNV desde el SNV anterior en el mismo cromosoma se traza contra la posición genómica de la mutación. Las líneas finas discontinuas indican los límites de los cromosomas. Los cromosomas se muestran en orden numérico; el cromosoma Z se muestra el último a la derecha. El color de cada punto ilustra el tipo de mutación según la clave que aparece en la parte inferior del panel. Las mutaciones con una distancia de intermutación de uno forman parte de las mutaciones de dinucleótidos. Se muestra un clon secuenciado de cada una. b Análisis de la secuencia de las 183 mutaciones dinucleotídicas detectadas tras el tratamiento con cisplatino. El cambio en la base 5′ se muestra en las filas, mientras que la base 3′ en las columnas. Las mutaciones equivalentes en las dos cadenas se suman, por ejemplo, GG > TT se muestra como CC > AA. Los tipos de mutación más comunes se agrupan debajo de la tabla y sus secuencias se indican utilizando la cadena rica en purinas para facilitar la interpretación. c Modelos esquemáticos del proceso replicativo que puede generar cada una de las clases más comunes de mutaciones mononucleotídicas (c) y dinucleotídicas (d) inducidas por cisplatino. Se marcan los posibles enlaces cruzados intracadena y se indica con un signo de interrogación la lesión incierta en las secuencias GA mutadas. El emparejamiento de bases no canónico se muestra con un símbolo de zig-zag. Se muestra la contribución de cada clase de mutación al número total de SNVs observados
De acuerdo con el hallazgo de mutaciones (pirimidina a adenina) a través de las bases 3′ y 5′ de las lesiones putativas de cisplatino intrasand, también detectamos 61 ± 21 mutaciones de dinucleótidos por muestra (Fig. 3a, Archivo adicional 1: Tabla S3). El 75% de estas mutaciones se encontraron en dinucleótidos AG, GG o GA. Curiosamente, estos cambiaron a un rango de secuencias, equivalente a la incorporación de dinucleótidos AA, AT, AC y AG frente al putativo entrecruzamiento intrastradial (Fig. 3d). Otra clase de mutación de dinucleótidos común fue CA > AC y 18 de 20 casos se encontraron en secuencias CCA. En la cadena opuesta estas mutaciones TGG > GTG podrían indicar cambios de base en la posición 5′ a los enlaces cruzados GG. La clasificación de las diferentes mutaciones de dinucleótidos se muestra en la Fig. 3b.
En conjunto, observamos mutaciones de sustitución de bases en la posición 5′ y en la posición 3′, así como en la posición anterior y posterior de los putativos entrecruzamientos intrastrand. La secuenciación del resultado replicado de un entrecruzamiento GG en un plásmido lanzadera sólo proporcionó pruebas suficientes de mutaciones en la posición 3′ y el número de mutaciones detectadas en gusanos C. elegans tratados con cisplatino permitió detectar las mismas mutaciones, así como mutaciones de dinucleótidos en probables entrecruzamientos AG . Nuestros datos de alta resolución indican mutagénesis en cada posición de un tramo de 4 pares de bases centrado en las lesiones GG y AG entrecruzadas.
Los entrecruzamientos inducidos por el cisplatino se forman en las secuencias GC , que sólo pueden estar presentes en los datos del espectro de tripletes como GCN. Asumiendo que, por analogía con las mutaciones observadas en los putativos entrecruzamientos intracadena, la causa más común de las mutaciones en las lesiones de entrecruzamiento intercadena sería la desincorporación de adenosina frente a la G central entrecruzada, estas mutaciones deberían presentarse como cambios GCN > GAN. Algunos de estos cambios en las bases del triplete ya se contaron anteriormente como posibles mutaciones inducidas por el entrecruzamiento intracadena. Sólo la combinación GCG > GAG no podría ocurrir en el sitio de un entrecruzamiento intrastrand, ya que GCG no contiene purinas vecinas. Estas mutaciones son muy raras (0,2 % de todas las SNV) después del tratamiento con cisplatino. En conclusión, nuestros datos no muestran una fuerte evidencia de mutaciones puntuales inducidas por los aductos del entrecruzamiento del cisplatino.
El tratamiento con cisplatino también indujo un número notable de mutaciones cortas de inserción y deleción, con un total de 132 ± 34 por muestra (Fig. 4a, Tabla 2, Archivo adicional 1: Tabla S1). Las inserciones eran casi exclusivamente de una base (el 95% de todas las inserciones, Fig. 4b). Clasificamos las inserciones de una base basándonos en su contexto de secuencia (Fig. 4c, Archivo adicional 1: Tabla S4). El 94% de las inserciones monobásicas eran pares de bases A/T. En la cadena con la inserción de timidina, las dos bases precedentes eran GG en el 81% de los casos, lo que presumiblemente representa el lugar de un enlace cruzado intracadena. La primera base que seguía a una inserción de timidina era un 84 % T, mientras que las dos primeras bases juntas eran un 51 % TT. Si el proceso mutagénico es la síntesis de ADN utilizando la hebra dañada como plantilla, podemos concluir que inserta preferentemente una adenosina extra cuando las bases 3′ al reticulado GG de la plantilla son timinas (véase la Fig. 4e para un modelo). Seis de las ocho inserciones de pares de bases C/G observadas se produjeron en sitios CC/GG (Fig. 4c), también sitios probables de enlaces cruzados intracadena.
Inserciones y deleciones inducidas por el cisplatino. a El número medio de inserciones (azul) y deleciones (rojo) observadas por genoma tras el régimen de tratamiento descrito con los fármacos indicados. Las barras de error indican el SEM. b Distribución de la longitud de las inserciones y deleciones inducidas por el cisplatino. c Mapa de calor de la frecuencia de las inserciones de una base, clasificadas según las dos bases precedentes y siguientes, como se indica. La base insertada se muestra debajo de cada panel. Las mutaciones equivalentes en las dos cadenas se añaden y se muestran como inserciones T o C. d Tabla y mapa de calor de la frecuencia de las supresiones de una base, clasificadas según la base anterior y la siguiente, como se indica. Las mutaciones equivalentes en las dos cadenas se añaden y se muestran como deleciones T o C, mostradas a la derecha. e Un modelo esquemático de la generación de las inserciones GGTT más comunes > GGTTT durante la replicación del ADN. La ADN polimerasa entrante (flecha gris) inserta adenosinas opuestas a las bases de timina, y luego inserta una adenosina extra al encontrar el entrecruzamiento de GG en la cadena inducido por cisplatino. f Contexto de la secuencia de las deleciones de un par de bases más comunes mostradas en la cadena rica en purinas, con la posición de los putativos enlaces cruzados intrastrand indicados sobre la secuencia
El 73% de las deleciones inducidas por el cisplatino eran de un par de bases. Una clasificación de la supresión de un par de bases basada en la base suprimida y las dos bases vecinas muestra que las supresiones más comunes afectaron a motivos de secuencia GG o AG, que pueden ser sitios de enlaces cruzados intracadena (Fig. 4d, f, Archivo adicional 1: Tabla S4). En el caso de AG, basándose en las supresiones AGC > AC y CAG > CG, es posible concluir que puede suprimirse el par de bases 3′ o 5′ de un supuesto dinucleótido AG reticulado. De acuerdo con esto, 40 de las 59 (68 %) supresiones de dos bases observadas eliminaron ambos pares de bases de los enlaces cruzados putativos AG o GG intrastrand (Archivo adicional 2: Figura S4).
La ciclofosfamida causa principalmente mutaciones T > A y C > T
La ciclofosfamida indujo 254 ± 50 mutaciones de sustitución de bases, lo que es más de cinco veces superior al tratamiento de prueba (p = 0,025, prueba t de Student). Los cambios de base más comunes fueron T > A y C > T, seguidos de un aumento más modesto en el número de mutaciones T > C y T > G (Fig. 2b). Se ha demostrado que la ciclofosfamida induce una serie de aductos en las siguientes proporciones Monoductos de N7-guanina (22 %), aductos reticulados (6-12 %) y aductos de fosfotriéster (67 %) . Los monoaductos de N7-guanina o los enlaces cruzados entre cadenas G-G pueden explicar las lesiones C > T. Para buscar evidencias de aductos entrecruzados, de los cuales los más comunes se han observado como aductos intercadena entre guaninas en secuencias GNC, buscamos preferencias de secuencia dos bases aguas arriba de las citosinas mutadas (archivo adicional 2: Figura S3), pero no pudimos encontrar evidencias sólidas de tales cambios. Las mutaciones prevalentes T > A, y también las más raras T > C y T > G, ocurren preferentemente en el centro de los tripletes NTT, con alguna preferencia adicional por CTT y TTT (Fig. 2d). Es poco probable que estas mutaciones sean causadas por aductos de guanina y pueden deberse a aductos de fosfotriéster. Las distancias de intermutación indicaron pocas mutaciones de dinucleótidos u otras agrupaciones de mutaciones (Fig. 3a). No hubo agrupación de mutaciones cuando se compararon diferentes clones tratados en caso de cisplatino o ciclofosfamida, lo que sugiere la falta de puntos calientes mutacionales y la distribución en gran medida aleatoria de las SNV (archivo adicional 2: Figura S5).
En contraste con el cisplatino, el tratamiento con ciclofosfamida no causó un aumento significativo en el número de mutaciones de inserción o deleción (Fig. 4a).
El tratamiento con etopósido eleva la frecuencia de sustitución de bases
Se investigaron otros seis fármacos por su potencial mutagénico: los antimetabolitos hidroxiurea, gemcitabina y 5-fluorouracilo, además del inhibidor de la topoisomerasa II etopósido, la antraciclina doxorrubicina y el agente antimicrotúbulos paclitaxel. Una comparación del número total de SNV para el tratamiento de prueba más estos seis tratamientos mediante ANOVA reveló una diferencia significativa (p = 0,025). En efecto, el etopósido indujo más del doble de mutaciones que el tratamiento de imitación, lo que supone una diferencia significativa por pares (p = 0,017, prueba t de Student). Cada categoría de sustitución de bases aumentó, lo que no supuso un cambio importante en el espectro general de mutaciones (Fig. 2c). En contraste con los SNVs, el número de indels no fue significativamente elevado en comparación con el tratamiento de simulación (Fig. 4a).
No se detectó ningún efecto mutagénico de la hidroxiurea, gemcitabina, 5-fluorouracilo, doxorrubicina y paclitaxel
Los tratamientos de 24 horas con hidroxiurea, gemcitabina, 5-fluorouracilo, doxorrubicina y paclitaxel no indujeron un número significativo de SNVs o indels adicionales en comparación con el tratamiento simulado (Figs. 2a, 4a, análisis ANOVA). Estos tratamientos tampoco cambiaron el espectro de mutaciones SNV espontáneas (Fig. 2c). Además, ninguno de los agentes probados, incluidos el cisplatino, la ciclofosfamida y el etopósido, indujeron indels más grandes (más de 100 pb) o eventos de reordenación del genoma, excepto una deleción de 3453 pb en un clon tratado con etopósido.
En conclusión, a concentraciones que matan una proporción moderada de células cultivadas, ninguno de los agentes hidroxiurea, gemcitabina, 5-fluorouracilo, doxorrubicina o paclitaxel indujo mutagénesis genómica medible. Por el contrario, en el mismo ensayo, el cisplatino y la ciclofosfamida indujeron un gran número de mutaciones con espectros de mutación distintos, mientras que el tratamiento con etopósido dio lugar a una mutagénesis por sustitución de bases marginalmente elevada.
Las menores tasas de mutagénesis en los genes aportan pruebas de tasas de reparación distintas
Las mutaciones inducidas por la quimioterapia tienen el potencial de alterar la función de los genes y, por tanto, de contribuir al desarrollo de resistencias o tumores secundarios. Para calibrar la importancia de este efecto, mapeamos las SNVs inducidas por cisplatino y ciclofosfamida con respecto a las secuencias génicas. En la versión del genoma Galgal4.82, el 44,2% del genoma del pollo está anotado para codificar transcripciones primarias. Curiosamente, una menor proporción de mutaciones inducidas por el tratamiento apareció en los genes (34,7 % y 35,1 %) de lo que se esperaba de una distribución uniforme (Fig. 5a). En relación con una distribución genómica uniforme, las mutaciones son un 17 % más probables en las regiones intergénicas, mientras que están un 22 % infrarrepresentadas en las regiones génicas. La explicación más probable para la reducción altamente significativa del número de SNV en los genes frente a las regiones intergénicas (p <0,001 tanto en el caso del cisplatino como de la ciclofosfamida, prueba χ2) es la actividad de la reparación acoplada a la transcripción (TCR), que puede eliminar las lesiones de una sola hebra de forma libre de errores . Hicimos uso de un conjunto de datos de RNA-seq de la línea celular DT40 para preguntar si el nivel de expresión de los genes influye en la densidad de mutaciones, como era de esperar si está influenciado por el TCR. De hecho, encontramos que la distribución de los genes mutados está sesgada hacia la baja expresión (Fig. 5b), lo que sugiere que la reparación sin errores de las lesiones es más eficiente en los genes altamente expresados. Además, el sesgo altamente significativo (p <0,001, prueba χ2) de la hebra de C > A inducida por cisplatino y de C > T inducida por ciclofosfamida en los genes apunta específicamente a una reparación eficiente de los aductos de guanina en la hebra transcrita por TCR (Fig. 5c).
Densidad de mutaciones con respecto a la transcripción del gen. a La proporción de regiones genómicas clasificadas como intergénicas (verde) o génicas (rojo) basada en la anotación genómica de Ensembl, mostrada a la izquierda, difiere de la proporción de SNVs inducidos por cisplatino o ciclofosfamida encontrados en las respectivas regiones (columnas central y derecha). b La distribución del nivel de expresión de todos los genes, basada en los datos de cobertura de RNA-Seq (verde) se muestra frente a la distribución del nivel de expresión de los genes que contienen SNVs inducidos por cisplatino o ciclofosfamida (rojo). Los niveles de expresión se muestran como el log10 de los valores FPKM (fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas). c Sesgo de cadena de las mutaciones genéticas inducidas por cisplatino (izquierda) o ciclofosfamida (derecha). Altamente significativo (p <0.001, prueba χ2) entre las cadenas no transcritas y las transcritas se indican con asteriscos dobles
Correlación de los patrones mutacionales identificados con firmas mutacionales en cáncer humano
Comparamos los diversos patrones mutacionales inducidos por el tratamiento con firmas mutacionales identificadas en cáncer humano (firmas COSMIC) . El espectro de tripletes normalizado del tratamiento simulado mostró una buena similitud visual con la firma 1 asociada al envejecimiento (Fig. 1d) debido a la presencia de mutaciones CG > TG. Sin embargo, esto no se confirmó en el análisis de correlación de Pearson (Fig. 6a), ya que en nuestras muestras tratadas de forma simulada hay una gama de tipos de mutaciones, además de las mutaciones CG > TG sobrerrepresentadas, mientras que la firma 1 no contiene esencialmente otros tipos de mutaciones. La firma 5 de amplio espectro también se asocia con el envejecimiento y observamos una correlación positiva entre esta firma y varios tratamientos que no cambiaron el perfil de mutaciones espontáneas (Fig. 6a). De acuerdo con el predominio de los procesos mutacionales relacionados con el envejecimiento, los perfiles de mutación de todos los tratamientos, excepto el cisplatino y la ciclofosfamida, muestran una buena correlación entre pares (Fig. 6b). Las mutaciones inducidas por el cisplatino se correlacionan bien con la firma 4 específica del tabaquismo y con la firma 24 inducida por la aflatoxina (Fig. 6a), lo que sugiere que estos agentes causan mutaciones por mecanismos similares. De hecho, las tres genotoxinas forman aductos voluminosos en las N7-guaninas, que son generadas por los hidrocarburos aromáticos policíclicos en el caso del humo del cigarrillo . Finalmente, las mutaciones inducidas por la ciclofosfamida sólo muestran una débil correlación con la rara firma 25 de etiología desconocida (Fig. 6a). Estos resultados demuestran que, si bien el análisis de mutagénesis en líneas celulares puede modelar los procesos mutacionales observados en el cáncer, como también lo demuestra la secuenciación del exoma de células humanas y de ratón tratadas con mutágenos y la secuenciación del genoma completo de clones individuales de fibroblastos embrionarios de ratón , es poco probable que las mutaciones inducidas por el tratamiento con cisplatino o ciclofosfamida hayan contribuido significativamente a las firmas COSMIC.
Correlación de los patrones de mutación inducidos por fármacos con las firmas de mutación identificadas en el cáncer. a Mapa de calor del coeficiente de correlación de Pearson entre los patrones de mutación de bases de tripletes inducidos por el tratamiento citotóxico ajustado a las frecuencias de tripletes humanos (filas) y las 30 firmas mutacionales confirmadas identificadas en el cáncer humano . La clave del mapa de calor se muestra en la parte inferior, con un histograma superpuesto que indica el número de células en cada rango de valores. b Mapa de calor que muestra los coeficientes de correlación de Pearson entre cada par de patrones mutacionales inducidos por el tratamiento
La quimioterapia mutagénica puede inducir resistencia a través de la reversión genética de los genes mutados
La quimioterapia mutagénica puede tener consecuencias muy importantes si las mutaciones inducidas contribuyen a la evolución subclonal de la resistencia al tratamiento en las células supervivientes. Buscamos pruebas de tal proceso entre las mutaciones documentadas que restauran la funcionalidad de los genes BRCA1 o BRCA2 mutados . Entre las siete mutaciones frameshift observadas que restauran la función del gen BRCA2 y causan resistencia tras el tratamiento con cisplatino de las células Capan-1 que llevan una deleción de una sola base en BRCA2 , encontramos dos casos de inserciones GGT > GGTT, que es con mucho la secuencia más común de las inserciones inducidas por cisplatino (Fig. 4c). Estas inserciones, 18 pb aguas abajo del par de bases eliminado, restauraron el marco de lectura, el nivel de proteína y la función de BRCA2 . En un estudio separado, una mutación sin sentido en BRCA2 se inactivó por un TAG > TAT SNV en un adenocarcinoma de ovario tratado con cisplatino tras una recaída resistente al cisplatino. En la línea celular PEO1 establecida a partir del tumor antes de la aparición de la resistencia al cisplatino, la selección de cisplatino condujo a mutaciones TAG > TTG del codón de parada en ocho de los ocho clones resistentes que restauraron la proteína BRCA2 . Nuestros resultados demuestran que la mutación de cualquiera de las bases a timina en los enlaces cruzados putativos de AG es una consecuencia común del tratamiento con cisplatino, con CT > AT (AG > AT) y CT > CA (AG > TG) mutaciones que constituyen el 12 % y el 7 % de todas las SNVs inducidas por cisplatino, respectivamente (Fig. 2d). El hallazgo de estas inserciones y SNVs inducidas por cisplatino recientemente identificadas en los revertantes de BRCA2 que surgen in vivo e in vitro sugiere con mucha fuerza que la terapia puede inducir directamente mutaciones causantes de resistencia.
Intentamos calcular una estimación de la probabilidad de que las mutaciones inducidas por el fármaco generen los cambios genéticos exactos necesarios para revertir las mutaciones de desplazamiento de marco o sin sentido. Si un cambio de marco de reversión debe producirse dentro de los 20 pares de bases de la mutación original y una SNV debe cambiar cualquiera de las tres bases de un codón de parada, entonces se necesitarían 108 indels colocados al azar, o 7 × 108 SNVs, para una probabilidad del 50% de que se produzca la mutación requerida en el genoma humano. Nuestro régimen experimental de tratamiento con cisplatino de cuatro ciclos indujo unos 130 indels y 800 SNVs por Gb. Si un régimen de tratamiento clínico tuviera el mismo efecto mutagénico, se necesitaría menos de 1 millón de células tumorales tratadas que sobrevivieran para que hubiera un 50% de posibilidades de reversión inducida por el tratamiento de un cambio de marco o de una supresión de una mutación sin sentido. Aunque en parte se basan en cifras especulativas, nuestras aproximaciones sugieren que el efecto de los tratamientos mutagénicos probablemente contribuye a la evolución de la resistencia a los fármacos a través del inicio de mutaciones de novo y de indels en los subclones de cáncer.