O uso in vitro de oito agentes quimioterápicos
Células isogénicas do tipo selvagem DT40 derivadas de um único clone celular foram tratadas com oito agentes citotóxicos diferentes comummente utilizados, representando cada uma das principais classes de quimioterápicas do cancro. Os agentes estão listados no Quadro 1. Para seleccionar uma concentração de tratamento, medimos a sensibilidade das células DT40 a cada fármaco utilizando um ensaio de sobrevivência clonogénico (Fig. 1a). Escolhemos condições de tratamento próximas da concentração de IC50 de cada fármaco que induzem apenas morte celular moderada, com 30-85 % das células sobreviventes, a fim de evitar a selecção de clones resistentes que poderiam comportar-se de forma diferente durante as rondas de tratamento subsequentes devido a potenciais alterações, por exemplo, no transporte do fármaco ou na reparação do ADN. Para as células sobreviventes, os tratamentos eram repetidos uma vez por semana ao longo de quatro ciclos, imitando os regimes de quimioterapia do cancro e aumentando a possibilidade de induzir mutações (Fig. 1b). Uma comparação da sensibilidade cisplatina de vários clones pós-tratamento com o clone inicial mostra que este regime de tratamento moderado não causou uma selecção significativa de resistência (Fig. 1b). 1c).
Tratamentos citotóxicos. Um ensaio de sobrevivência em colónia de células DT40 tratadas com os fármacos citotóxicos indicados durante 1 h (cisplatina, ciclofosfamida) ou 24 h. A concentração escolhida para os ensaios de mutagénese é indicada com setas negras. b Um desenho esquemático do ensaio de mutagénese. O ADN genómico foi sequenciado a partir do clone celular inicial e três clones celulares pós-tratamento. c Comparação da sensibilidade cisplatina do clone inicial (preto) e clones isolados após quatro rondas de tratamento cisplatina (vermelho). A média e SEM de três medições é mostrada
Um dos medicamentos testados, a ciclofosfamida, sofre activação por hidroxilação por enzimas citocromo P450 . Embora se pense que isto ocorra principalmente no fígado durante o tratamento terapêutico, também foi demonstrado que os linfócitos expressam as enzimas necessárias para a activação da ciclofosfamida . Portanto, devido à instabilidade e disponibilidade limitada do metabolito activo 4-hidroxiciclofosfamida, a ciclofosfamida foi adicionada às células na sua forma pró-fármaco. Cisplatina e ciclofosfamida, as duas drogas que se sabe formarem adutos de ADN, foram adicionadas durante 1 h com o raciocínio de que o seu efeito prejudicial ao ADN deveria ser largamente independente da fase do ciclo celular. Os restantes medicamentos foram utilizados em tratamentos de 24 h. Esta duração é o dobro da duração do ciclo celular DT40, assegurando que cada célula seria afectada pelo tratamento independentemente da fase do ciclo celular em que os fármacos exercem o seu efeito principal.
Variação do nucleótido único (SNV) e mutações curtas de inserção/delecção foram identificadas em três clones celulares derivados de cada tratamento utilizando o método IsoMut desenvolvido para este fim . Esta abordagem fornece informação de mutação para os genomas de três células individuais que passaram pelo regime de tratamento (Fig. 1b). Em resumo, comparámos todas as sequências genómicas obtidas neste estudo em cada posição genómica, e só aceitámos uma mutação se esta estivesse presente em exactamente uma amostra, satisfazendo os critérios de frequência mínima dos alelos mutantes, cobertura da amostra mutante, e frequência mínima dos alelos de referência de cada outra amostra. Devido à falta de disponibilidade de SNP validados e de conjuntos de dados curtos de mutações de inserção ou eliminação (indel), este método de detecção de mutações tem um desempenho muito melhor no genoma da galinha do que outros métodos habitualmente utilizados, identificando 90-95 % de todas as mutações com não mais de 0-5 SNVs falso-positivos por genoma.
Mutações espontâneas
Segundo um regime de tratamento falso que abrange aproximadamente 100 gerações de células, detectámos 47 ± 20 (SD) SNVs novos em três clones pós-tratamento (Tabela 2, Ficheiro adicional 1: Tabela S1). É provável que quase todas as mutações identificadas tenham realmente surgido durante o tratamento de simulação, uma vez que estas foram identificadas como mutações únicas entre todas as sequências genómicas obtidas para este estudo, e o mesmo método de detecção de mutações não encontrou SNVs únicas – que seriam falsos positivos – no clone inicial do pré-tratamento (Tabela 2). Das seis possíveis substituições de base (C > A, C > G, C > T, T > A, T > C, T > G), C > T transições e C > As transversões foram as mais comuns entre as mutações espontâneas (Fig. 2c, d). O número da mutação observada, projectado para o genoma diplóide de 2,06 × 109 pares de bases é equivalente a cerca de 2,3 × 10-10 mutações por base por divisão celular. Quando as mutações são vistas no contexto das bases vizinhas, e o “espectro espontâneo de mutações triplet” é normalizado à frequência de ocorrência genómica de cada triplet, torna-se aparente que as mutações NCG > NTG são mais comuns, presumivelmente devido a C > T substituições de base em sequências CpG metiladas . Calculámos que as mutações NCG > NTG eram 15× mais comuns do que a taxa média de mutação. Os espectros de trigémeos não normalizados são mostrados no ficheiro adicional 2: Figura S1.
Número e espectro de SNV induzidos pelo tratamento. a O número médio de SNV observados por genoma seguindo o regime de tratamento descrito com os medicamentos indicados. As barras de erro indicam SEM. b Espectro de substituição de base de mutações que surgiram do tratamento de simulação, bem como tratamentos cisplatina e ciclofosfamida. c O número médio de mutações por amostra e espectro de substituição de base dos tratamentos indicados. Diferenças significativas do tratamento de simulação (p <0,05, teste t de Student) são indicadas com um asterisco. d Espectros de mutação tripla dos tratamentos de simulação, cisplatina e ciclofosfamida. A base central de cada trigémeo, listada na parte inferior, sofreu uma mutação conforme indicado na parte superior do painel. O número de mutações de cada tipo foi normalizado à frequência de ocorrência desse trigémeo de base no genoma da galinha, e as taxas de mutação resultantes são mostradas
Cisplatina induz substituições de base e indels curtos
Cisplatina induz o maior número de SNV entre os oito medicamentos testados (Fig. 2a). Realizámos uma análise detalhada das mutações induzidas por cisplatina para melhor compreender os mecanismos mutagénicos. Detectámos 812 ± 193 SNV por clone pós-tratamento sequenciado. C/G > As transversões A/T foram mais comuns, representando 57% de todas as SNV, mas todas as seis classes de substituições de base aumentaram pelo menos quatro vezes (Fig. 2b). Olhando para SNV induzidas por cisplatina no contexto das bases vizinhas, é evidente que as mutações NCC > NAC são mais comuns, representando 40% de todos os casos de SNV. Outras alterações comuns são NCT > NAT e NTC > NAC, surgindo em 12% e 9% dos casos de SNV (Fig. 2d, Ficheiro adicional 2: Figura S1 e Figura S3 e Ficheiro Adicional 1: Tabela S2). Como a esmagadora maioria das lesões de ADN induzidas por cisplatina são ligações cruzadas intrastrand entre purinas vizinhas, estes três tipos de SNV poderiam representar mutações opostas à base de 3′ de dinucleótidos GG, AG e GA reticulados, respectivamente. No caso de ligações cruzadas de GG e AG intrastrand, estas mutações surgem através da incorporação incorrecta de uma adenosina oposta ao 3′ G da lesão (Fig. 3c). No entanto, as ligações cruzadas GA não foram observadas nos relatórios acima referidos. Portanto, catalogámos as bases em torno das 211 mutações TC observadas > AC (GA > GT), e descobriu que 159 incidências ocorreram no TCC > ACC ou TCT > sequências ACT, sugerindo que o par de base adjacente 3′ a um crosslink GG ou AG intrastrand também pode sofrer uma mutação. Das 52 mutações restantes, dez ocorreram na base de 5′ de potenciais ligações cruzadas AG em CTC > sequências CAC, mas nos restantes casos o único local potencial para uma ligação cruzada bipurina está em GA (ficheiro adicional 2: Figura S2). Concluímos que a cisplatina induz lesões mutagénicas em dinucleótidos GA, onde as lesões podem ser até agora não observadas em ligações cruzadas GA intrastrand ou monoadutos. Para completar a análise das mutações de um único nucleótido induzidas por cisplatina, notamos um enriquecimento de CCA > CAA e CTN > alterações de base CAN, sugerindo uma incorporação errada de adenosina em frente à base de 5′ de dinucleótidos GG ou AG reticulados.
espaçamento das mutações SNV, mutações dinucleotídicas e mecanismos propostos de mutações mono e dinucleotídicas. a A distância de cada mutação SNV da SNV anterior no mesmo cromossoma é traçada em relação à posição genómica da mutação. Linhas finas a tracejado indicam os limites cromossómicos. Os cromossomas são mostrados em ordem numérica; o cromossoma Z é mostrado em último à direita. A cor de cada ponto ilustra o tipo de mutação de acordo com a chave na parte inferior do painel. As mutações com uma distância de intermutação de um fazem parte das mutações de dinucleótidos. É mostrado um clone sequenciado de cada. b Análise sequencial das 183 mutações de dinucleótidos detectadas após tratamento cisplatina. A alteração da base de 5′ é mostrada nas filas, enquanto que a base de 3′ nas colunas. As mutações equivalentes nas duas vertentes são somadas, por exemplo, GG > TT é mostrado como CC > AA. Os tipos de mutações mais comuns são agrupados abaixo da tabela e as suas sequências são indicadas utilizando a vertente rica em purina para ajudar à interpretação. c Modelos esquemáticos para o processo de replicação que podem gerar cada uma das classes mais comuns de mononucleótidos (c) e dinucleótidos (d) induzidos por cisplâncton. As supostas ligações cruzadas intrastrand são marcadas, a lesão incerta nas sequências GA mutantes é indicada com um ponto de interrogação. O emparelhamento de base não canónica é indicado com um símbolo em zig-zag. A contribuição de cada classe de mutação para o número total de SNV observadas é mostrada
De acordo com a descoberta de mutações (pirimidina a adenina) em ambas as bases de 3′ e 5′ de supostas lesões intrastrand cisplatinadas, também detectámos 61 ± 21 mutações de dinucleótidos por amostra (Fig. 3a, Ficheiro adicional 1: Tabela S3). Setenta e cinco por cento destas mutações foram encontradas em dinucleótidos AG, GG ou GA. Curiosamente, estas mudaram para uma gama de sequências, equivalente à incorporação de dinucleótidos AA, AT, AC e AG em oposição ao putativo crosslink intrastrand (Fig. 3d). Uma outra classe comum de mutação de dinucleótidos foi CA > AC e 18 de 20 casos foram encontrados nas sequências CCA. Na vertente oposta estas TGG > mutações GTG poderiam indicar alterações de base na posição 5′ a GG crosslinks. A classificação de diferentes mutações de dinucleótidos é mostrada na Fig. 3b.
Fectuadas em conjunto, observámos mutações de substituição de base na posição 5′ e na posição 3′, bem como a anterior e a seguinte posição de ligações cruzadas putativas intrastrand. A sequência do resultado replicado de um crosslink GG num plasmídeo de vaivém apenas forneceu provas suficientes de mutações na posição 3′ e o número de mutações detectadas em vermes C. elegans tratados com cisplatina permitiu a detecção das mesmas mutações, bem como mutações de dinucleótidos em prováveis crosslinks AG. Os nossos dados de alta resolução indicam mutagénese em cada posição de um estiramento de 4 pares de bases centrado em lesões de GG e AG reticuladas.
As ligações cruzadas entre as cordas induzidas por cisplatina formam-se em sequências de GC , que só podem estar presentes nos dados de espectro triplo como GCN. Assumindo que, por analogia com as mutações observadas em putativas ligações cruzadas intranstrandas, a causa mais comum de mutações em lesões interstrandas transversais seria a incorporação errada de adenosina em relação ao G central reticulado, estas mutações devem apresentar-se como GCN > alterações de GAN. Algumas destas alterações de base tripla já foram contadas acima como potenciais mutações induzidas por crosslink intrastrand. Apenas a GCG > combinação GAG não poderia acontecer no local de um crosslink intrastrand, uma vez que GCG não contém purinas vizinhas. Estas mutações são muito raras (0,2% de todos os SNV) após tratamento cisplatina. Em conclusão, os nossos dados não mostram fortes evidências de mutações pontuais induzidas por adutos de cisplatina interstrand crosslink.
O tratamento cisplatina também induziu um número notável de mutações curtas de inserção e eliminação, num total de 132 ± 34 por amostra (Fig. 4a, Tabela 2, Ficheiro adicional 1: Tabela S1). As inserções foram quase exclusivamente uma base longa (95 % de todas as inserções, Fig. 4b). Classificámos as inserções de uma base com base no seu contexto de sequência (Fig. 4c, Ficheiro Adicional 1: Tabela S4). Noventa e quatro por cento das inserções de uma base eram pares de bases A/T. No cordão com a inserção da timidina, as duas bases anteriores eram GG em 81% dos casos, presumivelmente representando o local de um crosslink intrastrand Surpreendentemente, as bases que se seguiram ao local de inserção também mostraram forte preferência pela sequência. A primeira base após uma inserção de timidina foi 84% T, enquanto as duas primeiras bases juntas foram 51% TT. Se o processo mutagénico for a síntese de ADN utilizando o cordão danificado como modelo, podemos concluir que, de preferência, insere uma adenosina extra quando as bases 3′ ao modelo GG crosslink são timinas (ver Fig. 4e para um modelo). Seis das oito inserções do par de bases C/G observadas ocorreram em sítios CC/GG (Fig. 4c), também sítios prováveis de ligações cruzadas intrastrand.
Vinte e três por cento das supressões induzidas por cisplatina tinham um par de bases. Uma classificação de eliminação de um par de bases baseada na base eliminada e nas duas bases vizinhas mostra que as eliminações mais comuns afectaram os motivos de sequência GG ou AG, que podem ser locais de ligações cruzadas intra-estrada (Fig. 4d, f, Ficheiro adicional 1: Tabela S4). No caso de AG, com base no AGC > AC e CAG > supressões CG, é possível concluir que ou o par de bases de 3′ ou 5′ de um suposto dinucleótido AG reticulado pode ser eliminado. De acordo com isto, 40 de 59 (68%) observaram a eliminação de dois pares de bases de suposta ligação cruzada AG ou GG (Ficheiro adicional 2: Figura S4).
Ciclofosfamida causa principalmente T > A e C > Mutações T
Ciclofosfamida induziu 254 ± 50 mutações de substituição de bases, o que é mais de cinco vezes superior ao tratamento de simulação (p = 0,025, teste t de Student). As alterações de base mais comuns foram T > A e C > T, seguido de um aumento mais modesto no número de T > C e T > Mutações G (Fig. 2b). Foi demonstrado que a ciclofosfamida induz uma gama de aductos nas seguintes proporções: Monoadutos N7-guanina (22 %), aductos reticulados (6-12 %) e aductos fosfotriformes (67 %) . Os monoadutos N7-guanina ou as ligações cruzadas interstrand G-G podem ser responsáveis pelas lesões C > T. Para procurar evidências de adutos reticulados, dos quais os mais comuns foram observados como adutos entre as guaninas nas sequências GNC, procurámos preferências de sequência duas bases a montante de citosinas mutantes (Ficheiro adicional 2: Figura S3), mas não conseguimos encontrar fortes evidências de tais alterações. O prevalente T > Mutações A, e também o mais raro T > C e T > Mutações G, ocorrem preferencialmente no centro dos trigémeos NTT, com alguma preferência adicional por CTT e TTT (Fig. 2d). É pouco provável que estes sejam causados por adutos de guanina e, em vez disso, podem ser devidos a adutos fosfotriformes. As distâncias de intermutação indicam poucas mutações de dinucleótidos ou outro agrupamento de mutações (Fig. 3a). Não houve agrupamento de mutações quando se compararam diferentes clones tratados em caso de cisplatina ou ciclofosfamida, sugerindo a falta de pontos de mutação e a distribuição largamente aleatória de SNVs (Ficheiro adicional 2: Figura S5).
Em contraste com a cisplatina, o tratamento com ciclofosfamida não causou um aumento significativo do número de mutações de inserção ou eliminação (Fig. 3a). 4a).
O tratamento com etoposida eleva a frequência de substituição da base
Foram investigados mais seis medicamentos pelo seu potencial mutagénico: o antimetabolitos hidroxiureia, gemcitabina e 5-fluorouracil, mais o inibidor da topoisomerase II etoposida, a doxorubicina anthracycline e o agente antimicrotubular paclitaxel. Uma comparação dos números totais de SNV para o tratamento de simulação mais estes seis tratamentos por ANOVA revelou uma diferença significativa (p = 0,025). De facto, a etoposida induziu mais do dobro do número de mutações como o tratamento simulado, o que é uma diferença significativa em pares (p = 0,017, teste t de Student). Cada categoria de substituição de base aumentou, resultando em nenhuma alteração importante no espectro global de mutações (Fig. 2c). Em contraste com os SNV, o número de indels não foi significativamente elevado em comparação com o tratamento de simulação (Fig. 4a).
Nenhum efeito mutagénico detectável de hidroxiureia, gemcitabina, 5-fluorouracil, doxorubicina e paclitaxel
Tratamentos de 24 horas com hidroxiureia, gemcitabina, 5-fluorouracil, doxorubicina e paclitaxel não induziram um número significativo de SNVs ou indels extra em comparação com o tratamento de simulação (Figs. 2a, 4a, análise ANOVA). Estes tratamentos também não alteraram o espectro de mutação espontânea dos SNV (Fig. 2c). Além disso, nenhum dos agentes testados, incluindo cisplatina, ciclofosfamida e etoposida, induziu quaisquer indels maiores (mais de 100 bp) ou eventos de rearranjo do genoma, excepto uma eliminação de 3453-bp num clone tratado com etoposida.
Em conclusão, em concentrações que matam uma proporção moderada de células cultivadas, nenhuma de hidroxiureia, gemcitabina, 5-fluorouracil, doxorubicina ou paclitaxel induziu uma mutagénese genómica mensurável. Em contraste, no mesmo ensaio, a cisplatina e a ciclofosfamida induziram um grande número de mutações com espectros de mutação distintos, enquanto que o tratamento com etoposídeos resultou numa mutagénese de substituição de base marginalmente elevada.
Níveis mais baixos de mutagénese nos genes fornecem evidências de taxas de reparação distintas
Mutações induzidas por quimioterapia têm o potencial de alterar a função dos genes e, assim, contribuir para o desenvolvimento de resistência ou tumores secundários. Para avaliar a importância deste efeito, mapeámos os SNV induzidos por cisplatina e ciclofosfamida em relação a sequências de genes. Um total de 44,2 % do genoma da galinha é anotado em código para transcrições primárias na versão do genoma Galgal4.82. Curiosamente, uma proporção menor de mutações induzidas por tratamento apareceu nos genes (34,7% e 35,1%) do que o esperado a partir de uma distribuição uniforme (Fig. 5a). Em relação a uma distribuição genómica uniforme, as mutações têm 17 % mais probabilidade de ocorrer em regiões intergénicas, enquanto que estão 22 % subrepresentadas em regiões genéticas. A explicação mais provável para a redução altamente significativa dos números de SNV em genes versus regiões intergénicas (p <0,001 no caso de cisplatina e ciclofosfamida, χ2 test) é a actividade de reparação acoplada à transcrição (TCR), que pode remover lesões de um único cordão de forma sem erros . Fizemos uso de um conjunto de dados RNA-seq da linha de células DT40 para perguntar se o nível de expressão do gene influencia a densidade de mutação, como seria de esperar se fosse influenciado pelo TCR. De facto, descobrimos que a distribuição dos genes mutantes está inclinada para uma baixa expressão (Fig. 5b), sugerindo que a reparação sem erros das lesões é mais eficiente em genes altamente expressos. Além disso, altamente significativo (p <0.001, χ2 test) enviesamento da vertente de C > A e C > mutações T nos genes aponta especificamente para a reparação eficiente de adutos de guanina na vertente transcrita por TCR (Fig. 5b). 5c).
densidade de mutação com respeito à transcrição de genes. a A proporção de regiões genómicas classificadas como intergénicas (verde) ou genéticas (vermelho) com base na anotação do genoma Ensembl, mostrada à esquerda, difere da proporção de SNV induzidos por cisplatina ou ciclofosfamida encontrada nas respectivas regiões (colunas do meio e da direita). b A distribuição do nível de expressão de todos os genes, baseada nos dados de cobertura RNA-Seq (verde) é mostrada contra a distribuição do nível de expressão de genes contendo SNV induzidos por cisplatina ou ciclofosfamida (vermelho). Os níveis de expressão são mostrados como o log10 dos valores FPKM (fragmentos por kilobase de transcrição por milhão de leituras mapeadas). c Polarização dos fios de mutações genéticas induzidas por cisplatina (esquerda) ou ciclofosfamida (direita). Altamente significativo (p <0.001, χ2 test) as diferenças entre os fios não transcritos e os transcritos são indicadas com asteriscos duplos
Correlação dos padrões mutacionais identificados com assinaturas mutacionais no cancro humano
Comparamos os vários padrões mutacionais induzidos pelo tratamento com as assinaturas mutacionais identificadas no cancro humano (assinaturas COSMIC) . O espectro tríplice normalizado do tratamento simulado mostrou boa semelhança visual com a assinatura associada ao envelhecimento 1 (Fig. 1d) devido à presença de CG > mutações TG. No entanto, isto não foi confirmado na análise de correlação de Pearson (Fig. 6a), uma vez que nas nossas amostras tratadas com simulação existe uma gama de tipos de mutações para além das 15 sobre-representadas CG > mutações TG, enquanto que a assinatura 1 essencialmente não contém outros tipos de mutações. A assinatura 5 de largo espectro está também associada ao envelhecimento e observámos uma correlação positiva entre esta assinatura e vários tratamentos que não alteraram o perfil de mutação espontânea (Fig. 6a). De acordo com a dominância dos processos mutacionais relacionados com o envelhecimento, os perfis de mutação de todos os tratamentos excepto cisplatina e ciclofosfamida mostram uma boa correlação de pares (Fig. 6b). As mutações induzidas por cisplatina correlacionam-se bem com a assinatura 4 específica do fumo e a assinatura 24 induzida por aflatoxina (Fig. 6a), sugerindo que estes agentes causam mutações por mecanismos semelhantes. De facto, as três genotoxinas formam todas aductos volumosos a N7-guaninas, que são gerados por hidrocarbonetos aromáticos policíclicos no caso do fumo do cigarro . Finalmente, as mutações induzidas pela ciclofosfamida mostram apenas uma fraca correlação com a rara assinatura 25 da etiologia desconhecida (Fig. 6a). Estes resultados demonstram que embora a análise da mutagénese em linhas celulares possa modelar os processos mutacionais observados no cancro, como também evidenciado pela sequenciação exoma de ratos e células humanas tratadas com mutagénese e a sequenciação genómica inteira de clones de fibroblastos embrionários de ratos individuais, é improvável que as mutações induzidas pelo tratamento cisplatina ou ciclofosfamida tenham contribuído significativamente para as assinaturas COSMIC.
Correlação de padrões de mutação induzidos por drogas com assinaturas de mutação identificadas no cancro. um Mapa de calor do coeficiente de correlação de Pearson entre padrões de mutação de base tríplice induzidos pelo tratamento citotóxico ajustado às frequências de tríplice humano (filas) e as 30 assinaturas de mutação confirmadas identificadas no cancro humano . A chave do mapa de calor é mostrada na parte inferior, com um histograma sobreposto indicando o número de células em cada intervalo de valores. b Mapa de calor mostrando coeficientes de correlação de Pearson entre cada par de padrões mutacionais induzidos pelo tratamento
Quimioterapia mutagénica pode induzir resistência através da inversão genética dos genes mutantes
Quimioterapia mutagénica pode ter consequências muito significativas se as mutações induzidas contribuírem para a evolução subclonal da resistência ao tratamento nas células sobreviventes. Procurámos evidências de tal processo entre as mutações documentadas que restauram a funcionalidade dos genes BRCA1 ou BRCA2 mutantes. Entre sete mutações frameshift observadas para restaurar a função do gene BRCA2 e causar resistência após tratamento cisplatina das células de Capan-1 que transportam uma única supressão de base em BRCA2 , encontramos duas instâncias de GGT > inserções GGTT, que é de longe a sequência mais comum de inserções induzidas por cisplatina (Fig. 4c). Estas inserções, 18 bp a jusante do par de base eliminado, restauraram a moldura de leitura, o nível de proteína e a função do BRCA2 . Num estudo separado, uma mutação sem sentido em BRCA2 tornou-se inactivada por um TAG > TAT SNV num adenocarcinoma ovariano tratado com cisplatina após uma recidiva resistente à cisplatina. Na linha celular PEO1 estabelecida a partir do tumor antes do aparecimento da resistência cisplatina, a selecção cisplatina levou a TAG > mutações TTG do códon de paragem em oito dos oito clones resistentes que restauravam a proteína BRCA2 . Os nossos resultados mostram que a mutação de qualquer uma das bases para a timina em AG putativas ligações cruzadas intrastrand são uma consequência comum do tratamento cisplatina, com CT > AT (AG > AT) e CT > CA (AG > TG) mutações que constituem 12% e 7% de todos os SNV induzidos por cisplatina, respectivamente (Fig. 2d). A descoberta destas novas inserções induzidas por cisplatina e SNV em revertentes BRCA2 emergentes in vivo e in vitro sugere muito fortemente que a terapia pode induzir directamente mutações causadoras de resistência.
Tentamos calcular uma estimativa para a probabilidade de mutações induzidas por drogas gerando as alterações genéticas exactas necessárias para reverter as mutações de frameshift ou mutações sem sentido. Se um framehift de reversão precisar de acontecer dentro de 20 pares de bases da mutação original e um SNV precisar de alterar qualquer uma das três bases de um códon de paragem, então 108 indels colocados aleatoriamente, ou 7 × 108 SNV, seriam necessários para uma probabilidade de 50% da mutação necessária ocorrer no genoma humano. O nosso regime experimental de tratamento cisplatina de quatro ciclos induziu cerca de 130 indels e 800 SNV por Gb. Se um regime de tratamento clínico tivesse o mesmo efeito mutagénico, seria necessário menos de 1 milhão de células tumorais tratadas sobreviventes para uma hipótese de 50% de reversão de uma mutação sem sentido induzida pelo tratamento. Embora parcialmente baseadas em números especulativos, as nossas aproximações sugerem que o efeito dos tratamentos mutagénicos contribui provavelmente para a evolução da resistência aos medicamentos através do início de novas mutações e indels em subclones cancerígenos.