Imaging
Ultrasonografia mostrou que o plano da secção transversal do músculo quadríceps do paciente estava 7,2 SD acima do valor médio (±SD) para controlos de 10 anos e sexo (6,72 cm2 vs. 3,13±0,49 cm2). Além disso, a espessura do seu bloco de gordura subcutânea era 2,88 DP abaixo do valor médio para os controlos (0,18 cm vs. 0,36±0,06 cm). Não houve diferença significativa no diâmetro do osso femoral entre o doente e os controlos (0,57 cm vs. 0,50±0,13 cm). A ecogenicidade do músculo era normal, sem indicação de fibrose ou deposição de tecido adiposo (Figura 1B e Figura 1C).
Biologia molecular
Figura 2.
Figure 2. Análise da Mutação.
Painel A mostra os resultados da análise de restrição induzida por primer para a presença da mutação g.IVS1+5 g→a no paciente, na sua mãe, e num sujeito de controlo. AccI divide um fragmento de 166 bp em dois segmentos – um de 135 bp e outro de 31 bp – apenas se a sequência de tipo selvagem estiver presente. As pistas 3 e 4 mostram segmentos clivados (cortados) e tortos (não cortados) de um sujeito de controlo. O painel B mostra os resultados da PCR multiplex inversa-transcriptase do RNA do mensageiro (mRNA) do paciente e dois sujeitos de controlo em células linfoblastóides imortalizadas pelo vírus Epstein-Barr. Um gene de manutenção doméstica (HPRT) foi amplificado juntamente com vários fragmentos do gene da miostatina e produziu um produto de igual intensidade em todas as reacções. Nenhum produto da miostatina podia ser amplificado a partir do RNA do paciente, indicando a decomposição mediada sem sentido do mensageiro. O painel C mostra os produtos de PCR reversa-transcriptase gerados com a utilização de primários P2F e P4R a partir de construções de miostática do tipo selvagem (vias 1 e 2) e construções de miostática mutante (vias 3 e 4) transformadas em células COS-7, com (vias 1 e 3) e sem (vias 2 e 4) transcriptase reversa. Na presença da mutação, 68 por cento do mRNA precursor é emendado incorrectamente. O painel D mostra que a miostatina mutante tem uma transição g.IVS1+5 g→a no sítio doador da emenda no intron 1, causando a emenda de 108 bp a jusante num sítio de emenda críptica, o que produz uma transcrição maior no mutante e resulta num códon de terminação prematura. CMV denota sequências promotoras derivadas do citomegalovírus.
O fenótipo do nosso paciente fazia lembrar o aumento da musculatura e a diminuição da adiposidade relatada em ratos1,16-18 e bovinos10-13 com mutações de perda de função no gene da miostatina. Portanto, sequenciámos todos os exões e regiões de intrão de flanco do gene no paciente e na sua mãe. Embora não tenham sido detectadas mutações na região codificadora, uma transição g→a no nucleótido g.IVS1+5 estava presente em ambos os alelos do paciente e num alelo da sua mãe. A mutação foi confirmada pela análise de restrição (Figura 2A) e estava ausente em 200 alelos de indivíduos de controlo com antecedentes étnicos semelhantes, excluindo assim um polimorfismo comum.
A presença desta mutação levantou a possibilidade de emendas erradas do mRNA precursor da miostática no paciente, uma vez que a posição +5 no local doador da emenda é um local comum para mutações do local de emenda em humanos.19 Quando aplicámos o método de pontuação de Shapiro e Senapathy20 para analisar o grau de correspondência entre a sequência do local doador de emenda do intrão 1 com a sequência de consenso correspondente (AG//gtrag), a pontuação caiu de 79,4 (tipo selvagem, GT//gtaagt) para 65,0 (mutante, GT//gtaaat), indicando que é provável que se verifique uma má aplicação.
Para investigar o efeito desta mutação na maturação do mRNA miostatina, gerámos construções genómicas de tipo selvagem e mutante para a expressão do mRNA miostatina humana em células musculares e não musculares cultivadas e realizámos PCR de transcrituração inversa em RNA isolado das células transfectadas. A PCR através da fronteira entre o exon 1 e o exon 2 produziu uma banda única de 405 bp para a construção do tipo selvagem. Para a construção mutante, contudo, detectámos dois produtos de PCR, uma banda ténue de tamanho equivalente à obtida após a transfecção da construção do tipo selvagem e um produto novo importante de maior peso molecular (Figura 2C). Este produto continha uma inserção dos primeiros 108 bp de intron 1 (incluindo a mutação g.IVS1+5 g→a) e resultou da activação de um sítio de emenda críptica dentro do intron 1 (at//gtaagt) (Figura 2D). A quantificação das intensidades relativas das bandas maiores e menores obtidas a partir destas reacções PCR mostrou que 68,8±0,032 por cento (três amostras) do mRNA da miostática da construção mutante foi falhada (Figura 2C). Prevê-se que o mRNA falhado dê origem a uma proteína severamente truncada, uma vez que a inserção de 108-bp adiciona um único resíduo de lisina seguido de um códon de terminação prematura.
Figura 3.
Figure 3. Resultados de Western Blotting e Immunoprecipitation.
O painel A mostra a falta de produção de miostatina a partir de construções de miostatina genómica mutante em meio condicionado a partir de células COS-7 transfectadas transitoriamente. Os anticorpos contra o domínio terminal C maduro da miostatina reconhecem uma banda de 12-kD de construções do tipo selvagem (faixa 1) mas não de construções mutantes (faixa 2). Como controlo, as células foram cotransfectadas com uma proteína mico-tagged, que foi abundantemente expressa em ambas as populações. O painel B mostra os resultados da imunoprecipitação ou imunoprecipitação simulada (IP) e da mancha ocidental de amostras de soro de ratos (faixas 1, 2, e 3), sujeitos de controlo (faixas 4, 5, e 6), e o doente (faixa 7) com (faixas 1, 2, 4, 5, 7, e 8) ou sem (faixas 3 e 6) anticorpos JA-16 contra o domínio terminal da miostatina C como um imunoprecipitante. A mancha ocidental foi então sondada com anticorpos contra o propeptídeo miostático. Uma faixa correspondente ao propéptido de miosostatina estava presente em níveis elevados no soro de rato e, em menor grau, no soro de sujeitos de controlo e estava ausente no soro do doente.
Em consonância com os resultados da análise do RNA, a proteína da miosostatina foi detectada apenas no meio condicionado das células COS-7 transfectadas com a construção do tipo selvagem, enquanto que estava virtualmente ausente nas células transfectadas com a construção mutante (Figura 3A). Resultados semelhantes foram obtidos com outras linhas celulares, incluindo células do tipo Chinese-hamster-ovário e células de rabdomiossarcoma A204 (dados não mostrados).
Procurámos também confirmar o efeito desta mutação do local de emenda em amostras do paciente. Como nos faltava uma amostra de miópsia muscular, examinámos o mRNA miostatina das células linfoblastóides imortalizadas do EBV do paciente. Estas células tendem a expressar níveis baixos de transcrições ilegítimas, normalmente não presentes nas células sanguíneas. A transcrição ilegítima procede através dos promotores normais e pode ser utilizada para a detecção de mutações no nível de mRNA se não houver tecido específico disponível.21 Não encontrámos quaisquer produtos de miostatina em células do doente (Figura 2B). Acreditamos que a degradação geral do mRNA é uma explicação improvável para este resultado negativo, uma vez que fomos capazes de detectar níveis semelhantes de transcrições de um gene de manutenção doméstica (HPRT) no paciente e nos controlos. As transcrições mutantes podem ser especificamente degradadas através da decomposição mediada sem sentido do mensageiro, uma vez que o códão de terminação prematura está localizado a montante de um exon emendável.22
Finalmente, tentámos medir os níveis de mioestanho nas amostras de soro do paciente. A miostatina é prontamente detectada pela mancha ocidental em amostras de soro de ratos.3 Abordagens semelhantes revelaram-se muito mais difíceis em amostras de soro humano, presumivelmente porque os humanos têm níveis mais baixos de miostáticos em circulação. Utilizando um anticorpo contra a miostatina, primeiro concentramos a miostatina em amostras de soro por imunoprecipitação e depois detectamos a sua presença com um segundo anticorpo contra a região do propéptido. Optámos pelo anticorpo dirigido contra o propéptido (L8825), uma vez que este se liga mais fortemente e capta quantidades menores de proteína do que o anticorpo contra a miostatina madura. Identificámos uma faixa a aproximadamente 36 kD em soro de rato, correspondente à miostática do propeptídeo. Estava presente em menor grau nas amostras de soro de sujeitos de controlo de idade e sexo combinados, mas estava ausente no soro do doente (Figura 3B). Como a razão molar entre o propéptido e a miostatina madura no soro é aproximadamente 1:1,15, concluímos que a ausência do propéptido indica a ausência de miostatina madura no doente.