Como uma enzima supera a barreira energética de activação

A acção do corismate mutase é um paradigma da catálise enzimática, porque a enzima é uma proteína estruturalmente simples que acelera uma reacção unimolecular directa: uma reorganização intramolecular concertada do corismate para prefenato em que uma ligação carbono-carbono é formada e uma ligação carbono-oxigénio é quebrada (Fig. 1). A própria reacção é um passo vital na biossíntese dos aminoácidos aromáticos, emprestando à enzima uma importância biológica igual à sua importância na compreensão dos mecanismos de catálise. Nesta edição da PNAS, Hur e Bruice (1) aplicaram o conceito de conformação de quase ataque (NAC), que Bruice e colegas de trabalho têm vindo a desenvolver há vários anos (2, 3), às acelerações produzidas por várias mutações corismáticas diferentes, desenvolvendo assim o que se poderia chamar uma micro-história do processo catalítico para estas enzimas, traçando eventos entre o estado reactivo e o estado de transição. Os resultados são esclarecedores e susceptíveis de gerar considerável surpresa.

Explicar a catálise enzimática sempre constituiu um desafio adequado. As enzimas são poderosos catalisadores, alguns acelerando as suas reacções alvo por factores que podem exceder 1020 (4). Os mutações de corismate aceleram a sua reacção alvo por ≈106- a 107 vezes. Os detalhes de como tais acelerações são orquestradas no decurso de um processo em que a enzima encontra moléculas reagentes, podem, em alguns casos, pastoreá-las através de vários estados intermédios para a(s) molécula(s) do produto, e depois libertar esta última antes de lançar um novo ciclo catalítico, têm sido objecto de investigação, especulação, e debate desde a descoberta das enzimas.

Uma das principais ferramentas conceptuais para organizar as descobertas tem sido a percepção de Pauling (5) de que uma enzima é uma biomolécula que liga especificamente e assim estabiliza o estado de transição da reacção alvo. Quando se refere à versão habitual da teoria do estado de transição, a ideia de que uma enzima só alcança a catálise através da estabilização líquida do estado de transição tem sido um tema confortável em enzimologia mecanicista durante algum tempo (7). Esta formulação é aquela em que as constantes da taxa de reacção como o conhecido kcat e kcat/KM aumentam com a catálise apenas à medida que o catalisador diminui a diferença de energia livre de Gibbs entre o estado de transição e o estado reactivo. Oferece assim como uma grande vantagem a independência do caminho das funções do estado termodinâmico. A atenção poderia concentrar-se unicamente no estado de transição e no estado reactivo, sem considerar os estados intervenientes porque as suas propriedades não poderiam contribuir para a catálise. A micro-história de uma reacção enzimática poderia, portanto, ser considerada sem interesse porque nenhuma das suas características poderia influenciar as constantes de taxa experimentalmente observáveis.

Para muitos, as descobertas das últimas uma ou duas décadas começaram a sugerir que este relato é inadequado. Em particular, a descoberta e documentação por Klinman e colegas de trabalho do papel vital da escavação de túneis quânticos em reacções enzimáticas envolvendo a transferência de hidrogénio (8), levantou a questão de como incorporar exactamente estes efeitos na descrição das constantes de taxas. Estudos relacionados com o acoplamento ambiental na catálise de transferência de hidrogénio por Benkovic, Hammes-Schiffer, e os seus colegas de trabalho (9) estão a contribuir para esta reconsideração. Kuznetsov e Ulstrup (10) e Schwartz e colegas de trabalho (11), por exemplo, propuseram formulações alternativas às teóricas do estado de transição, enquanto que Gao e Truhlar (12) enfatizaram que as versões modernas da teoria do estado de transição, que estão muito longe de ser “ultra-simples”, são extremamente robustas e versáteis. Karplus (13, 14) reviu as perspectivas de incorporação na descrição de outras formas actuais e inovadoras de teoria, particularmente simulações dinâmicas, para fornecer uma imagem mais completa e satisfatória dos detalhes da catálise enzimática.

O tempo está, portanto, claramente, a chegar para que a nossa compreensão da catálise enzimática seja reforçada por descrições da micro-história entre o estado reactivo e o estado de transição, e a teoria é a ferramenta apropriada para a tarefa. Resta saber se a totalidade da nova informação irá eventualmente exigir uma abordagem conceptual distinta mesmo das poderosas versões modernas da teoria do estado de transição. Qualquer que seja o quadro teórico que será necessário, as questões básicas susceptíveis de serem iluminadas parecem ser numerosas. Em particular, a forma como as estruturas activas do sítio (e talvez redes remotas e alargadas na estrutura proteica) actuam para mover moléculas reagentes através da barreira energética é de grande interesse. Isto é particularmente verdadeiro para casos como o mutase corismático, em que átomos que se movem para formar e quebrar ligações são todos átomos pesados, não-hidrogénicos. A tunelização quântica não é então uma opção eficaz para alcançar a aceleração catalítica.

No seu desenvolvimento da micro-história da corismate mutase, Hur e Bruice (1) considere cinco exemplos diferentes de catálise de proteínas, bem como a reacção “não-catalítica” em solução aquosa. Mostram que existe no local activo de cada catalisador, numa população que reflecte exactamente a actividade catalítica desse catalisador, um NAC de corismate que está preparado para o evento crítico de formação de ligação (tendo a conformação global do estado de transição e a orientação correcta dos orbitais reagentes para a formação de ligação suave). Obtêm a energia livre padrão de formação do CNA em cada ambiente e depois subtraem este valor da energia livre de activação determinada experimentalmente para encontrar a energia livre necessária para converter o CNA em estado de transição. Este valor é uniformemente 16 kcal/mol para todos os catalisadores e para a reacção não catalisada em solução aquosa livre!

Hur e Bruice mostraram que as interacções catalíticas (interacções electrostáticas e hidrofóbicas) estabilizam uma conformação tipo estado de transição que se aproxima do estado de transição, excepto que a ligação de formação é mais longa por ≈1.5-2 Å do que será no estado de transição. Estas interacções constituem a totalidade das interacções atractivas que estabilizam o estado de transição. medida que a formação da ligação crítica e o encurtamento da ligação ocorrem, as interacções estabilizadoras são mantidas quantitativamente de modo a que uma barreira uniforme de 16 kcal/mol seja ultrapassada em cada caso catalítico e na reacção não-catalítica. medida que o estado de transição é atingido e a nova ligação é parcialmente formada, desaparece o custo energético de classificar as conformações reactivas a partir do vasto conjunto conformacional de corismate livre, a nova ligação que assegura a molécula na forma cíclica correcta. A totalidade das interacções catalisador-substrato atractivas aparece agora como estabilização do estado de transição.

Hur e Bruice identificam um número de resíduos de aminoácidos que estabilizam o CNA e o estado de transição em igual medida. Eles salientam particularmente o papel dos resíduos de arginina que interagem com os dois grupos de carboxilato de corismate para estabilizar a conformação que aproxima os dois átomos de carbono reactivos, e os resíduos de valina, isoleucina, leucina, e fenilalanina que fornecem um ambiente hidrofóbico para os fragmentos menos polares da molécula de corismate quando esta se encontra na conformação do NAC.

Os cálculos de Hur e Bruice sugerem uma explicação concebível para um resultado de outro modo algo mistificante de Hilvert e colegas de trabalho (15). Eles criaram um mutante corismate mutase com um resíduo de citrulina eletricamente neutro no lugar de arginina 90, um dos resíduos envolvidos na catálise. De facto, a catálise está fortemente comprometida, mas a enzima de tipo selvagem e a enzima mutante ligam um inibidor análogo de estado de transição com constantes de equilíbrio que são apenas ligeiramente diferentes (1.2 e 6.8 μM). Era de esperar que o inibidor, que está estruturalmente limitado a uma conformação que se assemelha tanto ao estado de transição como ao NAC, tivesse ligado à enzima mutante substancialmente menos fortemente (no local activo da enzima mutante, apenas uma pequena minoria do substrato se encontra na forma de NAC, que se encontra numa energia livre acima da do complexo enzima-substrato em 4,1 kcal/mol). Hur e Bruice descobrem que as suas simulações sugerem que as interacções inibidor-mutante da enzima são alteradas em relação às da enzima do tipo selvagem. Assim, é possível que a forte ligação do inibidor pela enzima mutante possa ser um artefacto desta ligação invulgar.

Uma micro-história de processos catalisados por enzimas traça eventos entre o estado reactivo e o estado de transição.

A micro-história de Hur e Bruice começa com o complexo enzimático-substrato, que nos catalisadores mais activos contém uma elevada população do NAC ou conformação reactiva. A micro-história pode ser prolongada um passo antes através de um estudo teórico de Guo et al. (16). Consideraram a questão de saber se a fracção muito pequena de conformações reactivas presentes entre as muitas outras conformações de corismate em solução livre é seleccionada e especificamente ligada pela enzima. A alternativa é que as conformações não reactivas mais comuns também podem ser ligadas e depois encontrar o seu caminho, talvez com ajuda da enzima, para a forma reactiva. A resposta é que os conformadores não reactivos são de facto ligados e que os grupos de locais activos ajudam a introduzi-los e a mantê-los na forma reactiva à medida que o sistema passa para o NAC e depois para o estado de transição.

A abordagem do NAC não carece de críticos, mas as novas descobertas devem ser congeniosas para alguns deles. No seu recente estudo do caso do mutase corismate, Strajbl et al. (17) notam que, embora também identifiquem um efeito NAC, deveria ser preferível centrar a atenção computacional no estado de transição “em vez de avaliar o efeito NAC que pode ou não ajudar a prever o efeito catalítico”. Em muitos casos, é claro, este seria um bom conselho. Mas, no caso particular da catálise de corismate mutase, Hur e Bruice descobrem agora que a energia livre da formação de CNA prevê precisamente a magnitude do efeito catalítico devido à barreira constante de 16 kcal/mol que é atravessada, a começar pela estrutura CNA, no caso de todas as reacções catalisadas e não catalisadas que examinaram.

As abordagens teóricas do mecanismo enzimático estão assim a expandir a nossa visão a partir daquela imposta pelas possibilidades limitadas de um tempo anterior, e a permitir-nos explorar acontecimentos em todos os pontos do percurso desde as moléculas reactivas até ao estado de transição.