Imagen
La ultrasonografía mostró que el plano de la sección transversal del músculo cuádriceps del paciente era 7,2 DE por encima del valor medio (±SD) de 10 controles emparejados por edad y sexo (6,72 cm2 frente a 3,13±0,49 cm2). Además, el grosor de su almohadilla de grasa subcutánea estaba 2,88 DE por debajo del valor medio de los controles (0,18 cm frente a 0,36±0,06 cm). No hubo diferencias significativas en el diámetro del hueso femoral entre el paciente y los controles (0,57 cm frente a 0,50±0,13 cm). La ecogenicidad del músculo era normal, sin indicación de fibrosis o depósito de tejido graso (Figura 1B y Figura 1C).
Biología molecular
Figura 2. 
Figura 2. Análisis de mutaciones.
El panel A muestra los resultados del análisis de restricción inducida por cebadores para la presencia de la mutación g.IVS1+5 g→a en el paciente, su madre y un sujeto de control. AccI escinde un fragmento de 166 pb en dos segmentos -uno de 135 pb y otro de 31 pb- sólo si la secuencia de tipo salvaje está presente. Los carriles 3 y 4 muestran los segmentos escindidos (cortados) y no escindidos (no cortados) de un sujeto de control. El panel B muestra los resultados de la PCR de transcriptasa inversa múltiple del ARN mensajero (ARNm) del paciente y de dos sujetos de control en células linfoblastoides inmortalizadas por el virus de Epstein-Barr. Se amplificó un gen de mantenimiento (HPRT) junto con varios fragmentos del gen de la miostatina y se obtuvo un producto de igual intensidad en todas las reacciones. No se pudo amplificar ningún producto de miostatina a partir del ARN de la paciente, lo que indica una decadencia del mensajero mediada por el sinsentido. El panel C muestra los productos de la PCR con transcriptasa inversa generados con el uso de los cebadores P2F y P4R a partir de construcciones de miostatina de tipo salvaje (carriles 1 y 2) y de construcciones de miostatina mutante (carriles 3 y 4) transfectadas en células COS-7, con (carriles 1 y 3) y sin (carriles 2 y 4) transcriptasa inversa. En presencia de la mutación, el 68% del ARNm precursor se empalma incorrectamente. El panel D muestra que la miostatina mutante tiene una transición g.IVS1+5 g→a en el sitio donante de empalme en el intrón 1, haciendo que el empalme se produzca 108 pb aguas abajo en un sitio de empalme críptico, lo que produce una transcripción más grande en el mutante y da lugar a un codón de terminación prematuro. CMV denota secuencias promotoras derivadas de citomegalovirus.
El fenotipo de nuestra paciente recordaba al aumento de la musculatura y la disminución de la adiposidad descritos en ratones1,16-18 y ganado10-13 con mutaciones de pérdida de función en el gen de la miostatina. Por lo tanto, secuenciamos todos los exones y las regiones de intrones flanqueantes del gen en el paciente y su madre. Aunque no se detectaron mutaciones en la región codificante, una transición g→a en el nucleótido g.IVS1+5 estaba presente en ambos alelos del paciente y en un alelo de su madre. La mutación se confirmó mediante un análisis de restricción (Figura 2A) y estuvo ausente en 200 alelos de sujetos de control con un origen étnico similar, excluyendo así un polimorfismo común.
La presencia de esta mutación planteó la posibilidad de un empalme erróneo del ARNm precursor de la miostatina en el paciente, ya que la posición +5 en el sitio donante del empalme es una ubicación común para las mutaciones del sitio de empalme en humanos.19 Cuando aplicamos el método de puntuación de Shapiro y Senapathy20 para analizar el grado de coincidencia entre la secuencia del sitio donante de empalme del intrón 1 con la correspondiente secuencia consenso (AG//gtrag), la puntuación descendió de 79,4 (tipo salvaje, GT//gtaagt) a 65,0 (mutante, GT//gtaaat), lo que indica que es probable que se produzca un missplicing.
Para investigar el efecto de esta mutación en la maduración del ARNm de la miostatina, generamos construcciones genómicas de tipo salvaje y mutante para la expresión del ARNm de la miostatina humana en células musculares y no musculares cultivadas y realizamos la PCR con transcriptasa inversa en el ARN aislado de las células transfectadas. La PCR a través del límite entre el exón 1 y el exón 2 produjo una única banda de 405 pb para el constructo de tipo salvaje. Para la construcción mutante, sin embargo, detectamos dos productos de PCR, una banda débil de tamaño equivalente a la obtenida tras la transfección de la construcción de tipo salvaje y un nuevo producto mayor de mayor peso molecular (Figura 2C). Este producto contenía una inserción de los primeros 108 pb del intrón 1 (incluyendo la mutación g.IVS1+5 g→a) y resultaba de la activación de un sitio de empalme críptico dentro del intrón 1 (at//gtaagt) (Figura 2D). La cuantificación de las intensidades relativas de las bandas mayores y menores obtenidas de estas reacciones de PCR mostró que el 68,8±0,032 por ciento (tres muestras) del ARNm de miostatina de la construcción mutante estaba mal empalmado (Figura 2C). Se prevé que el ARNm mal empalmado dé lugar a una proteína severamente truncada, ya que la inserción de 108 pb añade un único residuo de lisina seguido de un codón de terminación prematuro.
Figura 3. 
Figura 3. Resultados de Western Blotting e Inmunoprecipitación.
El panel A muestra la falta de producción de miostatina a partir de las construcciones de miostatina genómica mutante en el medio condicionado de las células COS-7 transfectadas transitoriamente. Los anticuerpos contra el dominio C-terminal maduro de la miostatina reconocen una banda de 12-kD de las construcciones de tipo salvaje (carril 1) pero no de las construcciones mutantes (carril 2). Como control, las células fueron cotransfectadas con una proteína marcada con myc, que se expresó abundantemente en ambas poblaciones. El panel B muestra los resultados de la inmunoprecipitación o del simulacro de inmunoprecipitación (IP) y del Western blot de muestras de suero de ratas (carriles 1, 2 y 3), de sujetos de control (carriles 4, 5 y 6) y del paciente (carril 7) con (carriles 1, 2, 4, 5, 7 y 8) o sin (carriles 3 y 6) anticuerpos JA-16 contra el dominio C-terminal de la miostatina como inmunoprecipitante. A continuación, el Western blot se sondeó con anticuerpos contra el propéptido de la miostatina. Una banda correspondiente al propéptido de miostatina estaba presente en altos niveles en el suero de rata y en menor grado en el suero de los sujetos de control y estaba ausente en el suero de la paciente.
Consistente con los resultados del análisis de ARN, la proteína miostatina se detectó sólo en el medio condicionado de las células COS-7 transfectadas con la construcción de tipo salvaje, mientras que estaba prácticamente ausente en las células transfectadas con la construcción mutante (Figura 3A). Se obtuvieron resultados similares con otras líneas celulares, incluidas las células de hámster-ovario chino y las células de rabdomiosarcoma A204 (datos no mostrados).
También tratamos de confirmar el efecto de esta mutación del sitio de empalme en muestras del paciente. Dado que carecemos de una muestra de biopsia muscular, examinamos el ARNm de miostatina de las células linfoblastoides inmortalizadas por el VEB del paciente. Estas células tienden a expresar niveles bajos de transcripciones ilegítimas, que normalmente no están presentes en las células sanguíneas. La transcripción ilegítima procede a través de los promotores normales y puede utilizarse para la detección de mutaciones a nivel de ARNm si no se dispone de tejido específico.21 No encontramos ningún producto de miostatina en las células del paciente (Figura 2B). Creemos que la degradación general del ARNm es una explicación poco probable para este resultado negativo, ya que pudimos detectar niveles similares de transcripciones de un gen de mantenimiento (HPRT) en el paciente y en los controles. Los transcritos mutantes pueden ser degradados específicamente a través de la decadencia del mensajero mediada por el sinsentido, ya que el codón de terminación prematuro se encuentra aguas arriba de un exón empalmable.22
Por último, intentamos medir los niveles de miostatina en las muestras de suero de los pacientes. La miostatina se detecta fácilmente mediante Western blot en muestras de suero de ratones.3 En las muestras de suero humano, enfoques similares han resultado mucho más difíciles, presumiblemente porque los humanos tienen niveles de miostatina circulante más bajos. Utilizando un anticuerpo contra la miostatina, primero concentramos la miostatina en muestras de suero por inmunoprecipitación y luego detectamos su presencia con un segundo anticuerpo contra la región del propéptido. Optamos por el anticuerpo dirigido contra el propéptido (L8825), ya que se une más estrechamente y recoge cantidades más pequeñas de proteína que el anticuerpo contra la miostatina madura. Identificamos una banda de aproximadamente 36 kD en suero de rata, correspondiente al propéptido de miostatina. Estaba presente en menor grado en las muestras de suero de los sujetos de control emparejados por edad y sexo, pero estaba ausente en el suero del paciente (Figura 3B). Dado que la relación molar entre el propéptido y la miostatina madura en el suero es de aproximadamente 1:1,15 concluimos que la ausencia del propéptido indica la ausencia de miostatina madura en el paciente.