Fate-mapping studies
Identificare le origini cellulari dei tessuti in rigenerazione è una questione fondamentale in biologia della rigenerazione. Diversi studi hanno eseguito analisi di fate-mapping per indagare l’origine cellulare del muscolo cardiaco durante la rigenerazione del cuore nello zebrafish. Utilizzando tecniche genetiche inducibili fate-mapping (Buckingham e Meilhac, 2011), due studi hanno esaminato direttamente il contributo dei cardiomiociti al cuore di zebrafish rigenerante (Jopling et al., 2010; Kikuchi et al., 2010). In entrambi i casi, sono state utilizzate due linee transgeniche: una linea porta un 4-hydroxytamoxifen (4-HT) – gene Cre ricombinasi inducibile (CreER) da cui l’espressione è guidata nei cardiomiociti dal promotore del gene della catena leggera della miosina cardiaca 2 (cmlc2), noto anche come catena leggera della miosina 7 (myl7) gene; e l’altra è una linea indicatrice in cui l’espressione della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) può essere indotta in cellule che esprimono CreER dopo l’escissione della cassetta di arresto trascrizionale loxP-flanked da trattamenti di 4-HT (Jopling et al., 2010; Kikuchi et al., 2010). Utilizzando questo sistema, quasi tutti i cardiomiociti che esprimono cmlc2 sono stati pre-etichettati con EGFP da 4-HT trattamenti prima di lesioni, e gli esperimenti di rigenerazione sono stati eseguiti 30 giorni dopo la resezione ventricolare. I risultati di entrambi gli studi hanno mostrato chiaramente che la stragrande maggioranza del miocardio rigenerato è etichettato con EGFP, senza alcuna differenza significativa rilevata nella proporzione di cardiomiociti EGFP + nel tessuto rigenerato rispetto ai ventricoli non feriti, indicando che cmlc2 + cardiomiociti esistenti, ma non cmlc2- non-miociti, sono la fonte principale per il nuovo muscolo durante la rigenerazione del cuore di zebrafish.
Cellule derivate dall’epicardio (EPDCs) hanno precedentemente dimostrato di contribuire e regolare la vascolarizzazione durante la rigenerazione cardiaca in zebrafish (Kim et al, 2010; Lepilina et al., 2006); tuttavia, il loro contributo alla rigenerazione del miocardio non è stato testato direttamente. Studi recenti hanno affrontato questo problema utilizzando due approcci diversi: destino genetico-mapping (Kikuchi et al., 2011a) e trapianto (González-Rosa et al., 2012). Nello studio di fate-mapping genetico inducibile, le sequenze cis-regolatorie del fattore di trascrizione 21 (tcf21), noto anche come Epicardina (Robb et al., 1998), Pod1 (Quaggin et al., 1999), Capsulina (Hidai et al., 1998; Lu et al, 1998), sono stati utilizzati per indirizzare CreER all’epicardio di zebrafish (Serluca, 2008), e la sua progenie sono stati tracciati durante la rigenerazione dopo CreER-dipendente etichettatura con EGFP, che è stato indotto da una linea indicatore con un trattamento transitorio 4-HT. Nel test di trapianto, un pezzo di tessuto cardiaco è stato raccolto dal ventricolo ferito del ceppo β-actina:EGFP, in cui la maggior parte delle cellule cardiache, comprese le cellule epicardiche, sono state marcate con EGFP, e trapiantato in un cuore wild-type appena ferito che era stato irradiato prima della ferita per sopprimere la proliferazione delle cellule nel tessuto ricevente. In entrambi gli studi, molte cellule con EGFP sono state rilevate nel rigenerato e caratterizzate istologicamente come miofibroblasti (González-Rosa et al., 2012) e cellule perivascolari (González-Rosa et al., 2012; Kikuchi et al., 2011a), ma non come cardiomiociti (González-Rosa et al., 2012; Kikuchi et al., 2011a). Questi risultati indicano che l’epicardio o EPDCs non danno origine al muscolo cardiaco durante la rigenerazione del cuore di zebrafish, che è coerente con la scoperta che i cardiomiociti sono la fonte principale per rigenerare il miocardio.
Gli esperimenti di lineage tracing sopra descritti non hanno affrontato se la popolazione cmlc2 + include più tipi di cellule muscolari che possono contribuire in modo diverso alla rigenerazione. Recentemente, Poss e colleghi hanno generato un sistema transgenico che permette l’etichettatura clonale multicolore dei cardiomiociti, e definito lignaggi miocardici precedentemente non caratterizzati, rivelando i loro comportamenti durante la morfogenesi del cuore di zebrafish (Gupta e Poss, 2012). Questo sistema consisteva di due alleli transgenici, cmlc2:CreER (Kikuchi et al., 2010) e una cassetta reporter multicolore chiamato priZm, che è stato costruito utilizzando la tecnologia Brainbow originariamente sviluppato per visualizzare i singoli neuroni e connessioni nel cervello del mouse (Livet et al., 2007) (Fig. 1A). Utilizzando questo sistema, gli autori hanno indotto l’etichettatura clonale multicolore a 2 giorni dopo la fecondazione, ed eseguito analisi delle immagini in varie fasi di sviluppo per caratterizzare in dettaglio come cloni cardiomiociti si comportano durante la morfogenesi del cuore.
Figura 1. Nuove fonti cellulari per il muscolo cardiaco. (A) Un sistema transgenico per l’etichettatura clonale multicolore dei cardiomiociti. La cassetta priZm esprime una proteina reporter fluorescente rossa (RFP) come colore predefinito sotto il controllo del promotore β-actin2. La ricombinazione differenziale tra i siti lox2272 (triangolo nero) o loxP (triangolo bianco) accoppiati induce l’espressione della proteina fluorescente ciano (CFP) o della proteina fluorescente gialla (YFP), rispettivamente. Il ceppo transgenico priZm porta inserzioni tandem multicopia della cassetta indicata in un singolo locus genetico, e limitata Cre-mediata eventi di escissione ai siti loxP o lox2272 produrre molti colori possibili permanente con varie combinazioni di RFP, CFP, e l’espressione YFP. Questa strategia permette l’etichettatura clonale multicolore dei cardiomiociti nel doppio contesto transgenico con il ceppo cmlc2:CreER (Kikuchi et al., 2010) dopo trattamenti tamoxifene (Gupta e Poss, 2012). (B) Lineamenti muscolari nel ventricolo zebrafish. Tr, muscolo trabecolare; Pr, muscolo primordiale. (C) Rigenerazione delle cellule muscolari primordiali e corticali. Frecce e punte di freccia nei pannelli centrale e destro indicano il bordo dei cloni migranti dello strato muscolare primordiale e la parete ventricolare riparata dallo strato muscolare corticale, rispettivamente. Linea tratteggiata: piano di amputazione. La figura è una sintesi del lavoro di Poss e colleghi (Gupta e Poss, 2012).
Il ventricolo di zebrafish è stato riconosciuto per contenere due tipi di muscolo cardiaco, composto da una parete periferica chiamata strato compatto e uno strato trabecolare interno (Hu et al., 2001). Formazione di trabecole ha dimostrato di verificarsi attraverso delaminazione dei cardiomiociti dal muscolo della parete ventricolare (Liu et al., 2010). L’approccio di etichettatura clonale descritto sopra ha raffinato questa comprensione anatomica e di sviluppo del cuore di zebrafish. In primo luogo, gli autori hanno scoperto che la parete muscolare esterna del tubo cardiaco embrionale persiste anche nel ventricolo adulto. Per adattarsi alla crescita cardiaca, questo strato muscolare si espande solo in modo circonferenziale per tutta la vita del pesce, mantenendo uno spessore di un solo cardiomiocita come si vede nel cuore embrionale. Questo lignaggio muscolare, chiamato muscolo primordiale, persiste per formare lo strato più interno della parete muscolare periferica del ventricolo adulto (Fig. 1B, pannello destro). In secondo luogo, gli autori hanno osservato che allo stadio giovanile, lo strato muscolare primordiale è penetrato da alcuni cloni di cardiomiociti trabecolari – ~ 8 cloni per ventricolo – come eventi rari e spazialmente segregati, e questi cloni di cardiomiociti dominanti crescono su tutto lo strato primordiale, creando un altro muro muscolare che costituisce lo strato più esterno della parete muscolare periferica del ventricolo adulto (Fig. 1B). Questa stirpe muscolare è chiaramente distinta dalle stirpi muscolari trabecolare e primordiale, ed è stata chiamata strato muscolare corticale. Così, nella vista raffinata, il ventricolo adulto di zebrafish è costituito da tre diversi lignaggi muscolari, il muscolo primordiale, trabecolare e corticale, e questi lignaggi si sviluppano in questa sequenza temporale durante lo sviluppo (Gupta e Poss, 2012).
Dopo la definizione dei lignaggi muscolari distinti, una domanda interessante da porre è se questi lignaggi contribuiscono in modo diverso alla rigenerazione del cuore. Gli autori hanno eseguito esperimenti di rigenerazione utilizzando ventricoli di pesci adulti cmlc2:CreER; priZm in cui l’etichettatura clonale multicolore era stata indotta in uno stadio embrionale come descritto sopra. A 14 giorni dopo la lesione, cloni muscolari corticali adiacenti alla ferita espanso in direzioni laterali e radiali nel sito della lesione, ma l’integrazione delle cellule muscolari primordiali non si è verificato in questo momento (Fig. 1C, pannello centrale). Entro 30 giorni dopo la lesione, come muscolo corticale ricostruito la parete muscolare, cloni dello strato muscolare primordiale è diventato rilevabile nel rigenerato, e un completo strato primordiale è stato ripristinato, formando un confine unico strato cellulare tra il muscolo trabecolare e corticale rigenerato da 60 giorni dopo il trauma (Fig. 1C, pannello destro). Così, entrambi gli strati muscolari primordiali e corticali contribuiscono al rigenerato, ma sono formati in ordine inverso rispetto alla sequenza di sviluppo normale. Muscolo primordiale si espande solo circonferenzialmente, come osservato durante la morfogenesi cardiaca, mentre il muscolo corticale si espande in modo meno limitato e contribuisce la massa maggiore della nuova parete ventricolare. Questo risultato è coerente con l’osservazione precedente che il muscolo rigenerato nei cuori amputati deriva principalmente da una sottopopolazione di miociti nella parete laterale del ventricolo in cui il fattore di trascrizione cardiogenico gata4 è attivato (Kikuchi et al, 2010).
Più recentemente, lo stesso gruppo ha eseguito simili analisi clonali multicolori su cellule muscolari corticali gata4+ e cmlc2+ con etichettatura indotta allo stadio adulto, e questi esperimenti hanno rivelato che, a differenza della morfogenesi ventricolare iniziale, non vi è alcuna dominanza clonale nelle cellule muscolari corticali durante la rigenerazione (Gupta et al., 2013), suggerendo che il meccanismo di proliferazione utilizzato dai cardiomiociti durante la rigenerazione è diverso da quello utilizzato durante lo sviluppo cardiaco.