Immagini
L’ecografia ha mostrato che il piano della sezione trasversale del muscolo quadricipite del paziente era 7,2 SD sopra il valore medio (±SD) per 10 controlli abbinati per età e sesso (6,72 cm2 contro 3,13±0,49 cm2). Inoltre, lo spessore del suo cuscinetto di grasso sottocutaneo era 2,88 SD sotto il valore medio dei controlli (0,18 cm contro 0,36±0,06 cm). Non c’era una differenza significativa nel diametro dell’osso femorale tra il paziente e i controlli (0,57 cm contro 0,50±0,13 cm). L’ecogenicità del muscolo era normale, senza alcuna indicazione di fibrosi o deposizione di tessuto grasso (Figura 1B e Figura 1C).
Biologia molecolare
Figura 2.
Figura 2. Analisi delle mutazioni.
Pannello A mostra i risultati dell’analisi di restrizione indotta da primer per la presenza della mutazione g.IVS1+5 g→a nel paziente, sua madre e un soggetto di controllo. AccI scinde un frammento di 166 bp in due segmenti – uno di 135 bp e uno di 31 bp – solo se è presente la sequenza wild-type. Le corsie 3 e 4 mostrano i segmenti scissi (tagliati) e non scissi (non tagliati) da un soggetto di controllo. Il pannello B mostra i risultati della PCR multiplex con trascrizione inversa dell’RNA messaggero (mRNA) del paziente e di due soggetti di controllo in cellule linfoblastoidi immortalizzate dal virus di Epstein-Barr. Un gene housekeeping (HPRT) è stato amplificato insieme a vari frammenti del gene della miostatina e ha dato un prodotto di uguale intensità in tutte le reazioni. Nessun prodotto della miostatina potrebbe essere amplificato dall’RNA del paziente, indicando il decadimento del messaggero mediato dal nonsenso. Pannello C mostra i prodotti di reverse-trascrittasi PCR generato con l’uso di P2F e P4R primer da wild-type miostatina costrutti (corsie 1 e 2) e costrutti miostatina mutante (corsie 3 e 4) trasfettati in COS-7 cellule, con (corsie 1 e 3) e senza (corsie 2 e 4) trascrittasi inversa. In presenza della mutazione, il 68 per cento del mRNA precursore è splicato in modo errato. Il pannello D mostra che la miostatina mutante ha una transizione g.IVS1+5 g→a al sito donatore di splicing nell’introne 1, causando lo splicing a verificarsi 108 bp a valle in un sito di splicing criptico, che produce una trascrizione più grande nel mutante e risulta in un codone di terminazione prematura. CMV denota sequenze promotore derivato da cytomegalovirus.
Il fenotipo del nostro paziente ricordava l’aumento della muscolatura e diminuzione dell’adiposità riportato nei topi1,16-18 e bovini10-13 con mutazioni di perdita di funzione nel gene della miostatina. Pertanto, abbiamo sequenziato tutti gli esoni e le regioni introne fiancheggianti del gene nel paziente e sua madre. Sebbene non siano state rilevate mutazioni nella regione codificante, una transizione g→a al nucleotide g.IVS1+5 era presente in entrambi gli alleli del paziente e in un allele di sua madre. La mutazione è stata confermata dall’analisi di restrizione (Figura 2A) ed era assente in 200 alleli di soggetti di controllo con un background etnico simile, escludendo così un polimorfismo comune.
La presenza di questa mutazione ha sollevato la possibilità di missplicing dell’mRNA precursore della miostatina nel paziente, poiché la posizione +5 al sito donatore di splice è una posizione comune per mutazioni di splice-site nell’uomo.19 Quando abbiamo applicato il metodo di punteggio di Shapiro e Senapathy20 per analizzare il grado di corrispondenza tra la sequenza del sito donatore di splice dell’introne 1 con la corrispondente sequenza di consenso (AG//gtrag), il punteggio è sceso da 79,4 (wild type, GT//gtaagt) a 65,0 (mutante, GT//gtaaat), indicando che il missplicing è probabile.
Al fine di indagare l’effetto di questa mutazione sulla maturazione dell’mRNA della miostatina, abbiamo generato costrutti genomici wild-type e mutanti per l’espressione dell’mRNA della miostatina umana in cellule muscolari e non muscolari in coltura ed eseguito la PCR con trascrizione inversa sull’RNA isolato dalle cellule trasfettate. La PCR attraverso il confine tra l’esone 1 e l’esone 2 ha prodotto una singola banda di 405 bp per il costrutto wild-type. Per il costrutto mutante, tuttavia, abbiamo rilevato due prodotti di PCR, una banda debole di dimensioni equivalenti a quella ottenuta dopo la trasfezione del costrutto wild-type e un nuovo prodotto principale di peso molecolare superiore (Figura 2C). Questo prodotto conteneva un’inserzione dei primi 108 bp dell’introne 1 (compresa la mutazione g.IVS1+5 g→a) e risultava dall’attivazione di un sito di splice criptico all’interno dell’introne 1 (at//gtaagt) (Figura 2D). La quantificazione delle intensità relative delle bande maggiori e minori ottenute da queste reazioni PCR ha mostrato che 68.8±0.032 per cento (tre campioni) del mRNA della miostatina dal costrutto mutante era misspliced (Figura 2C). Si prevede che l’mRNA missplicato dia origine a una proteina gravemente troncata, poiché l’inserzione di 108 bp aggiunge un singolo residuo di lisina seguito da un codone di terminazione prematuro.
Figura 3.
Figura 3. Risultati di Western Blotting e immunoprecipitazione.
Pannello A mostra la mancanza di produzione di miostatina dai costrutti di miostatina genomica mutante nel mezzo condizionato da cellule COS-7 transitoriamente trasfettate. Anticorpi contro il maturo dominio C-terminale della miostatina riconoscere una banda 12-kD da wild-type costrutti (corsia 1), ma non costrutti mutanti (corsia 2). Come controllo, le cellule sono state cotrasfettate con una proteina myc-tagged, che era abbondantemente espressa in entrambe le popolazioni. Il pannello B mostra i risultati di immunoprecipitazione o mock immunoprecipitazione (IP) e Western blotting di campioni di siero di ratti (corsie 1, 2, e 3), soggetti di controllo (corsie 4, 5, e 6), e il paziente (corsia 7) con (corsie 1, 2, 4, 5, 7, e 8) o senza (corsie 3 e 6) JA-16 anticorpi contro il dominio C-terminale della miostatina come immunoprecipitante. Il Western blot è stato poi analizzato con anticorpi contro il propeptide della miostatina. Una banda corrispondente al propeptide della miostatina era presente ad alti livelli nel siero di ratto e in misura minore nel siero dei soggetti di controllo ed era assente nel siero del paziente.
Consistente con i risultati dell’analisi dell’RNA, la proteina della miostatina è stata rilevata solo nel mezzo condizionato dalle cellule COS-7 trasfettate con il costrutto wild-type, mentre era praticamente assente nelle cellule trasfettate con il costrutto mutante (Figura 3A). Risultati simili sono stati ottenuti con altre linee cellulari, tra cui cellule di criceto-ovario cinese e cellule di rabdomiosarcoma A204 (dati non mostrati).
Abbiamo anche cercato di confermare l’effetto di questa mutazione splice-site in campioni dal paziente. Poiché ci mancava un campione di biopsia muscolare, abbiamo esaminato l’mRNA della miostatina dalle cellule linfoblastoidi immortalate con EBV del paziente. Queste cellule tendono ad esprimere bassi livelli di trascrizioni illegittime, normalmente non presenti nelle cellule del sangue. La trascrizione illegittima procede attraverso i promotori normali e può essere utilizzata per il rilevamento di mutazioni a livello di mRNA se il tessuto specifico non è disponibile.21 Non abbiamo trovato alcun prodotto della miostatina nelle cellule del paziente (Figura 2B). Crediamo che la degradazione generale di mRNA è una spiegazione improbabile per questo risultato negativo, dal momento che siamo stati in grado di rilevare livelli simili di trascrizioni di un gene housekeeping (HPRT) nel paziente e controlli. Le trascrizioni mutanti possono essere specificamente degradate attraverso il decadimento del messaggero mediato dal nonsenso, poiché il codone di terminazione prematura si trova a monte di un esone giunturabile.22
Infine, abbiamo cercato di misurare i livelli di miostatina nei campioni di siero del paziente. La miostatina è facilmente rilevata tramite Western blotting in campioni di siero di topi.3 Approcci simili si sono dimostrati molto più difficili in campioni di siero umano, presumibilmente perché gli esseri umani hanno livelli di miostatina in circolazione più bassi. Utilizzando un anticorpo contro la miostatina, abbiamo prima concentrato la miostatina in campioni di siero da immunoprecipitazione e poi rilevato la sua presenza con un secondo anticorpo contro la regione propeptidica. Abbiamo optato per l’anticorpo diretto contro il propeptide (L8825), poiché si lega più strettamente e raccoglie quantità minori di proteina rispetto all’anticorpo contro la miostatina matura. Abbiamo identificato una banda a circa 36 kD nel siero di ratto, corrispondente al propeptide della miostatina. Era presente in misura minore nei campioni di siero di soggetti di controllo di pari età e sesso, ma era assente nel siero del paziente (Figura 3B). Poiché il rapporto molare tra propeptide e miostatina matura nel siero è circa 1:1,15 concludiamo che l’assenza del propeptide indica l’assenza di miostatina matura nel paziente.