Come un enzima supera la barriera dell’energia di attivazione

L’azione della corismato mutasi è un paradigma della catalisi enzimatica, perché l’enzima è una proteina strutturalmente semplice che accelera una reazione unimolecolare diretta: un riarrangiamento concertato, intramolecolare del corismato a pre-fenato in cui si forma un legame carbonio-carbonio e si rompe un legame carbonio-ossigeno (Fig. 1). La reazione stessa è un passo vitale nella biosintesi degli aminoacidi aromatici, conferendo all’enzima un’importanza biologica pari alla sua importanza nella comprensione dei meccanismi di catalisi. In questo numero di PNAS, Hur e Bruice (1) hanno applicato il concetto di conformazione vicina all’attacco (NAC), che Bruice e colleghi hanno sviluppato per diversi anni (2, 3), alle accelerazioni prodotte da diverse mutasi di corismato, sviluppando così quella che potrebbe essere chiamata una microstoria del processo catalitico per questi enzimi, tracciando gli eventi tra lo stato reagente e lo stato di transizione. I risultati sono illuminanti e probabilmente genereranno notevole sorpresa.

Spiegare la catalisi enzimatica ha sempre rappresentato una sfida adeguata. Gli enzimi sono potenti catalizzatori, alcuni accelerano le loro reazioni bersaglio con fattori che possono superare 1020 (4). Le chorismate mutasi accelerano la loro reazione bersaglio da ≈106- a 107 volte. I dettagli di come tali accelerazioni siano orchestrate nel corso di un processo in cui l’enzima incontra le molecole reagenti, può, in alcuni casi, guidarle attraverso vari stati intermedi fino alla molecola o alle molecole di prodotto, e poi rilascia queste ultime prima di lanciare un nuovo ciclo catalitico, sono stati oggetto di ricerca, speculazione e dibattito fin dalla scoperta degli enzimi.

Uno dei principali strumenti concettuali per organizzare i risultati è stata l’intuizione di Pauling (5) che un enzima è una biomolecola che si lega specificamente e quindi stabilizza lo stato di transizione della reazione bersaglio. Quando è formulata nella consueta versione da chimico delle soluzioni della teoria dello stato di transizione, l’idea che un enzima raggiunga la catalisi solo per mezzo della stabilizzazione netta dello stato di transizione è stato un tema confortevole nell’enzimologia meccanicistica per qualche tempo (7). Questa formulazione è quella in cui le costanti di velocità di reazione come le familiari kcat e kcat/KM aumentano con la catalisi solo perché il catalizzatore diminuisce la differenza di energia libera di Gibbs tra lo stato di transizione e lo stato reagente. Offre quindi come grande vantaggio l’indipendenza dal percorso delle funzioni di stato termodinamiche. L’attenzione potrebbe essere focalizzata solo sullo stato di transizione e sullo stato reagente, senza considerare gli stati intermedi perché le loro proprietà non potrebbero contribuire alla catalisi. La microstoria di una reazione enzimatica potrebbe quindi essere considerata priva di interesse perché nessuna delle sue caratteristiche potrebbe influenzare le costanti di tasso osservabili sperimentalmente.

Per molti, le scoperte degli ultimi uno o due decenni hanno cominciato a suggerire che questo conto è inadeguato. In particolare, la scoperta e la documentazione di Klinman e colleghi del ruolo vitale del tunneling quantistico nelle reazioni enzimatiche che coinvolgono il trasferimento di idrogeno (8), ha sollevato la questione di come incorporare esattamente questi effetti nella descrizione della costante di tasso. Studi correlati sull’accoppiamento ambientale nella catalisi di trasferimento dell’idrogeno da parte di Benkovic, Hammes-Schiffer e i loro colleghi (9) stanno contribuendo a questa riconsiderazione. Kuznetsov e Ulstrup (10) e Schwartz e colleghi (11), per esempio, hanno proposto formulazioni alternative a quelle teoriche dello stato di transizione, mentre Gao e Truhlar (12) hanno sottolineato che le versioni moderne della teoria dello stato di transizione, che sono molto lontane dall'”ultrasemplice”, sono estremamente robuste e versatili. Karplus (13, 14) ha esaminato le prospettive di incorporare nella descrizione altre forme attuali e innovative di teoria, in particolare le simulazioni dinamiche, per fornire un quadro più completo e soddisfacente dei dettagli della catalisi enzimatica.

È quindi chiaramente giunto il momento di migliorare la nostra comprensione della catalisi enzimatica con descrizioni della microstoria tra stato reagente e stato di transizione, e la teoria è lo strumento appropriato per questo compito. Resta da vedere se la totalità delle nuove informazioni richiederà alla fine un approccio concettuale distinto anche dalle potenti versioni moderne della teoria dello stato di transizione. Qualunque sia il quadro teorico che sarà necessario, le questioni di base che potrebbero essere illuminate sembrano numerose. In particolare, il modo in cui le strutture del sito attivo (e forse le reti remote ed estese nella struttura della proteina) agiscono per spostare le molecole reagenti attraverso la barriera energetica è di grande interesse. Questo è particolarmente vero per casi come il corismato mutasi, dove gli atomi che si muovono per formare e rompere i legami sono tutti pesanti, atomi non idrogeno. Il tunneling quantistico non è quindi un’opzione efficace per ottenere un’accelerazione catalitica.

Nel loro sviluppo della microstoria della corismato mutasi, Hur e Bruice (1) considerano cinque diversi esempi di catalisi proteica così come la reazione “non catalizzata” in soluzione acquosa. Mostrano che un NAC di corismato che è pronto per l’evento critico di formazione del legame (avendo la conformazione generale dello stato di transizione e l’orientamento corretto degli orbitali di reazione per una formazione regolare del legame) esiste nel sito attivo di ogni catalizzatore in una popolazione che riflette esattamente l’attività catalitica di quel catalizzatore. Si ottiene l’energia libera standard di formazione del NAC in ogni ambiente e poi si sottrae questo valore dall’energia libera di attivazione determinata sperimentalmente per trovare l’energia libera richiesta per convertire il NAC allo stato di transizione. Questo valore è uniformemente 16 kcal/mol per tutti i catalizzatori e per la reazione non catalizzata in soluzione acquosa libera!

Hur e Bruice hanno quindi dimostrato che le interazioni del catalizzatore (interazioni elettrostatiche e idrofobiche) stabilizzano una conformazione simile allo stato di transizione che approssima lo stato di transizione, tranne che il legame di formazione è più lungo di ≈1,5-2 Å di quanto non sia nello stato di transizione. Queste interazioni costituiscono la totalità delle interazioni attrattive che stabilizzano lo stato di transizione. Mentre si verificano la formazione critica del legame e l’accorciamento del legame, le interazioni stabilizzanti sono mantenute quantitativamente in modo che una barriera uniforme di 16 kcal/mol sia superata in ogni caso catalitico e nella reazione non catalizzata. Quando lo stato di transizione è raggiunto e il nuovo legame è parzialmente formato, il costo energetico di selezionare le conformazioni reattive dalla vasta gamma conformazionale del corismato libero scompare, il nuovo legame che assicura la molecola nella forma ciclica corretta. La totalità delle interazioni attrattive catalizzatore-substrato appare ora come stabilizzazione dello stato di transizione.

Hur e Bruice identificano una serie di residui aminoacidici che stabilizzano il NAC e lo stato di transizione in egual misura. Sottolineano in particolare il ruolo dei residui di arginina che interagiscono con i due gruppi carbossilati del corismato per stabilizzare la conformazione che porta i due atomi di carbonio reattivi in prossimità, e i residui di valina, isoleucina, leucina e fenilalanina che forniscono un ambiente idrofobico per i frammenti meno polari della molecola di corismato quando è nella conformazione NAC.

I calcoli di Hur e Bruice suggeriscono una spiegazione concepibile per un risultato altrimenti un po’ mistificante di Hilvert e colleghi (15). Hanno creato una chorismate mutase mutante con un residuo di citrullina elettricamente neutro al posto dell’arginina 90, uno dei residui coinvolti nella catalisi. In effetti, la catalisi è fortemente compromessa, ma l’enzima wild-type e l’enzima mutante legano un inibitore analogo allo stato di transizione con costanti di equilibrio solo leggermente diverse (1,2 e 6,8 μM). Ci si sarebbe potuto aspettare che l’inibitore, che è strutturalmente vincolato a una conformazione simile sia allo stato di transizione che alla NAC, si sarebbe legato all’enzima mutante in modo sostanzialmente meno forte (nel sito attivo dell’enzima mutante, solo una piccola minoranza del substrato si trova nella forma NAC, che si trova a un’energia libera superiore a quella del complesso enzima-substrato di 4,1 kcal/mol). Hur e Bruice trovano che le loro simulazioni suggeriscono che le interazioni enzima inibitore-mutante sono alterate da quelle dell’enzima wild-type. Quindi, è possibile che il forte legame dell’inibitore da parte dell’enzima mutante sia un artefatto di questo legame insolito.

Una microstoria dei processi catalizzati dall’enzima traccia gli eventi tra lo stato reagente e lo stato di transizione.

La microstoria di Hur e Bruice inizia con il complesso enzima-substrato, che nei catalizzatori più attivi contiene un’alta popolazione della conformazione NAC o reattiva. La microstoria può essere estesa un passo prima da uno studio teorico di Guo et al. (16). Essi hanno considerato la questione se la piccolissima frazione di conformazioni reattive presenti tra le molte altre conformazioni del corismato in soluzione libera sia selezionata e specificamente legata dall’enzima. L’alternativa è che le conformazioni non reattive più comuni possono anche essere legate e poi trovare la loro strada, forse con l’assistenza dell’enzima, nella forma reattiva. La risposta è che i conformatori non reattivi sono effettivamente legati e che i gruppi del sito attivo aiutano a portarli e a mantenerli nella forma reattiva mentre il sistema passa al NAC e poi allo stato di transizione.

L’approccio NAC non manca di critici, ma i nuovi risultati dovrebbero essere congeniali ad alcuni di loro. Nel loro recente studio sul caso della corismato mutasi, Štrajbl et al. (17) notano che, sebbene anche loro identifichino un effetto NAC, dovrebbe essere preferibile centrare l’attenzione computazionale sullo stato di transizione “piuttosto che valutare l’effetto NAC che potrebbe o meno aiutare a prevedere l’effetto catalitico”. In molti casi, naturalmente, questo sarebbe un buon consiglio. Ma nel caso particolare della catalisi del corismato mutasi, Hur e Bruice trovano ora che l’energia libera di formazione del NAC predice precisamente la grandezza dell’effetto catalitico a causa della barriera costante di 16 kcal/mol che viene attraversata, a partire dalla struttura del NAC, nel caso di tutte le reazioni catalizzate e non catalizzate che hanno esaminato.

Gli approcci teorici al meccanismo enzimatico stanno quindi espandendo la nostra visione da quella imposta dalle possibilità limitate di un tempo precedente, e ci permettono di esplorare gli eventi in tutti i punti del percorso dalle molecole reagenti attraverso lo stato di transizione.