Use of Biomarkers
Perché gli organismi bentonici sono esposti a molteplici fattori di stress e non è sempre possibile testare la presenza di particolari contaminanti nei tessuti, c’è stata una ricerca di indicatori che dimostrino la tossicità dei contaminanti. I biomarcatori sono stati definiti come risposte cellulari o biochimiche a fattori di stress ambientale, ma questa definizione è stata ampliata per includere risposte fisiologiche, chimiche, genotossiche, molecolari o comportamentali (Scott e Sloman, 2004; Monserrat et al., 2007). I biomarcatori sono attualmente utilizzati per valutare le condizioni delle acque costiere europee (Hagger et al., 2009).
Anche se i biomarcatori sono stati classificati in diversi modi, essi si raggruppano in tipi specifici o non specifici. Esempi di biomarcatori specifici includono la MT, che rappresenta le concentrazioni di metalli in tracce nel tessuto corporeo, e l’attività della colinesterasi che è stata proposta come biomarcatore specifico per l’organofosforo, i pesticidi carbomati e le neurotossine (Monserrat et al., 2007). In alternativa, ci sono biomarcatori non specifici come il danno al DNA, l’ossidazione delle proteine e le risposte antiossidanti, che riflettono combinazioni di fattori di stress (Geracitano et al., 2004). I biomarcatori di danno al DNA sono strumenti preziosi per valutare gli effetti dell’esposizione acuta e cronica degli animali acquatici a sostanze genotossiche (Amado et al., 2006). Qualsiasi cambiamento positivo o negativo è importante perché può essere trasmesso alle generazioni future e avere conseguenze ecologiche.
La ricerca sui biomarcatori negli ultimi 10 anni è stata ampia e, mentre si è concentrata su cozze e pesci (van der Oost et al., 2003), ci sono stati anche studi su molluschi, ostriche, vongole, capesante, policheti e crostacei. Per le cozze, una vasta gamma di biomarcatori è stata testata in Europa. Mariogomez et al. (2013) hanno recentemente valutato cinque sistemi di biomarcatori, compreso un biomarcatore di risposta integrato (IBR) che utilizza biomarcatori biochimici, istochimici e istologici di effetto. Utilizzando un set di dati a lungo termine di cozze raccolte come parte di un programma di monitoraggio delle cozze dopo la fuoriuscita di petrolio della Prestige, hanno studiato quali biomarcatori erano sensibili allo stress ambientale. Hanno anche concluso che, sebbene gli indici differissero per sensibilità e risultati, tutti erano utili per semplificare l’interpretazione degli effetti biologici dell’inquinamento. Hanno concluso, tuttavia, che perché questi siano efficaci, è necessario comprendere i meccanismi alla base delle risposte allo stress. Inoltre, c’è bisogno di capire se ci sono cambiamenti stagionali nelle risposte dei biomarcatori e alcuni indici sembrano più potenti quando il numero di biomarcatori utilizzati aumenta. Infine, è necessario conoscere i livelli di fondo e i valori di base per le aree in studio. Uno dei migliori biomarcatori per l’esposizione ai metalli è il carico di metalli nei tessuti, che varia a seconda del particolare tessuto testato. Inoltre, MTs sono proteine a basso peso molecolare, che regolano i livelli di metalli essenziali labili, come Zn e Cu, nelle cellule e ridurre gli effetti dannosi delle specie reattive dell’ossigeno. Alcuni scienziati mettono in dubbio la specificità delle MT sostenendo che sono prodotte in risposta ad altri fattori di stress e in studi più vecchi è stata trovata poca correlazione tra l’induzione di MT e l’esposizione ai metalli (Chapman et al., 2003). L’espressione di questa proteina è anche indotta da ipossia, segnali endocrini e stress ossidativo ed è anche influenzata dallo sviluppo delle gonadi e dalla disponibilità di cibo. La capacità di sintetizzare la MT differisce tra i molluschi marini, in alcuni i livelli aumentano nelle regioni dove le concentrazioni sono più alte. I livelli nella capasanta, A. gibbus, erano più alti nelle branchie da capesante contaminate da acque reflue comunali (Quinn et al., 2005).
Per esaminare gli effetti dell’esposizione ai metalli sulle capesante, Regoli et al. (1998) hanno misurato le risposte lisosomiali e antiossidanti nella ghiandola digestiva della capasanta antartica dopo l’esposizione a rame e mercurio. Più recentemente, Liu et al. (2012) hanno campionato C. farreri da siti che differivano per i contaminanti. L’acqua e i tessuti delle capesante (branchie e ghiandole digestive) sono stati testati per i metalli in traccia (Cu, Cd, Pb e Zn) e 16 IPA. Sono stati misurati anche la GST (glutatione-S-transferasi), le rotture del filamento di DNA, il contenuto proteico e la perossidazione lipidica. La GST era inibita e l’idrossilasi degli idrocarburi arilici (responsabile della fase ossidativa iniziale nel metabolismo di una varietà di PAH) era elevata in un sito dove i livelli di PAH erano alti. Per Argopecten purpuratus, Zapata et al. (2012) hanno anche misurato le concentrazioni di metalli per Cu, Cd e Pb nelle branchie e nella ghiandola digestiva, tre geni coinvolti nello stress e nel metabolismo ossidativo (GPx, GST e HSP70) e un marker proteico (MT). Un insieme di biomarcatori aumenta il potenziale per distinguere i siti con diversi livelli di contaminanti. Hanno trovato che i geni di shock termico sono stati indotti; questo è stato trovato per altri bivalvi esposti a tracce di metalli come Hg e può riflettere il danno cellulare che si verifica anche con l’aumento delle temperature.
Utilizzando una combinazione di fattori di stress, Nahrgang et al. (2013) misurato livelli di base di metalli e IPA in cozze e la capasanta islandese, Chlamys islandica, stagionalmente in 2010. Hanno misurato una buona gamma di biomarcatori tra cui la stabilità della membrana lisosomiale negli emociti, le riserve di energia nelle ghiandole digestive, e lo stress ossidativo e gli enzimi antiossidanti (GST, CAT e GPX), e perossidazione lipidica (TBARS-sostanze reattive tiobarbituriche), insieme alla capacità totale di scavenging ossidativo (TOSC). Hanno trovato che alcuni dei livelli di biomarcatori variavano stagionalmente, forse in risposta all’aumento dei nutrienti e alle temperature più elevate e hanno concluso che le misure congiunte di TBARS e TOSC hanno fornito una misura migliore dello stress ossidativo durante l’anno rispetto alle misure di CAT, GPX e GST. Questa ricerca fornisce ora una piattaforma per ulteriori studi in aree di elevata esposizione nota di metalli traccia o altri contaminanti. Tuttavia, è importante capire la variabilità naturale e come gli inquinanti influenzano i biomarcatori e se interagiscono in modo sinergico o antagonista.
I biomarcatori dello stress ossidativo sono utili perché possono fornire alcuni dei primi segnali di stress agli organismi (Regoli et al., 2000; Valko et al., 2005; Valavanidis et al., 2006). I biomarcatori comunemente usati sia nei pesci che nei mitili includono la catalasi (CAT), la glutatione perossidasi (GPX) e la perossidazione lipidica, insieme al TOSC. Camus et al. (2002) hanno iniettato la capasanta islandese con due concentrazioni di benzo(a) pirene (BaP)-PAH nel muscolo adduttore per 4 giorni e hanno campionato l’emolinfa dal muscolo adduttore e dai tessuti dell’epatopancreas. La presenza di antiossidanti ha depresso l’attività TOSC, dimostrando un effetto contaminante. In un lavoro più recente, Pan et al. (2009) hanno misurato le risposte dei biomarcatori antiossidanti della piccola Chlamys farreri allo stesso IPA, utilizzando i tessuti delle branchie e della ghiandola digestiva. È stata trovata una relazione dose-risposta affidabile tra il BaP e l’attività della 7-etossiresorufina-O-deetilasi nella ghiandola digestiva e GST, SOD, CAT, GPx e LPO proposti come strumenti da utilizzare negli studi di stress e tossicità. Hannam et al. (2010) hanno trovato prove di stress ossidativo e risposte immunotossiche nella capasanta islandese Chlamys islandica dopo l’esposizione a livelli di IPA di 163 µg L-1 per un periodo di 21 giorni. Dopo la cessazione dell’esposizione, non c’è stato alcun recupero della funzione immunitaria, suggerendo che c’era il potenziale per effetti sub-letali a lungo termine per continuare.
Le colinesterasi (ChE) e AChE sono idrolasi della serina che svolgono un ruolo nella neurotrasmissione e sono gli enzimi bersaglio di pesticidi organofosforici (OP) e carbammati (CB). Bocquene (1997) non ha trovato alcuna prova di inibizione dell’AChE negli estratti del muscolo adduttore che indicherebbe la presenza di contaminanti insetticidi, ma Owen et al. (2002) hanno riportato l’inibizione dell’attività AChE e BChE nell’emolinfa della capasanta tropicale Euvola (Pecten) ziczac al pesticida OP chloropyrifos. Regoli et al. (1997, 1998) hanno proposto di utilizzare le risposte lisosomiali e antiossidanti nell’Adamussium colbecki come strumento di allarme precoce per rilevare disturbi ambientali nell’ambiente antartico. Anche le attività ChE sono state determinate per altri substrati nei tessuti della capasanta antartica A. colbecki (Bonacci et al., 2004; Corsi et al., 2004; Bonacci et al., 2008), che hanno mostrato risposte dose-dipendenti al cloropirifos, come trovato in altri bivalvi. Mentre ChE era stato considerato come biomarcatore specifico per questi composti, altri scienziati suggeriscono che potrebbe essere influenzato da una serie di contaminanti tra cui IPA, metalli in tracce e miscele complesse. Questo è stato trovato per estratti del corpo intero di due specie di cozze esposte a dosi crescenti di Cd e Zn (Najimi et al., 1997). Bonacci et al. (2008) hanno testato le risposte ChE di Pecten jacobaeus all’OP azamethiphos e diisopropylfluorophosphate, cadmio e zinco utilizzando tessuti dalle branchie, ghiandola digestiva e muscolo adduttore. Hanno trovato risposte tessuto-specifiche e inibizione dose-dipendente di ChE in risposta all’esposizione in vitro al cadmio e all’azametifos, ma la sensibilità allo zinco e al DFC era inferiore. La suscettibilità delle branchie è stata la più alta dei tre tessuti testati e mette in evidenza gli effetti del danno perché questi sono il sito primario per la respirazione e lo scambio ionico. È importante testare gli effetti dei biomarcatori su altri contaminanti e su specie di capesante provenienti da regioni temperate, tropicali e polari. Bonacci et al. (2009) hanno misurato le risposte ChE della capasanta antartica A. colbecki esposta a organofosfati e idrocarburi policiclici, PAH e PCB. I risultati per PAH e PCB hanno suggerito una risposta ChE, ma questo non era dose-dipendente e PCB da solo non ha suscitato una risposta. La mancanza di una risposta concentrazione-dose suggerisce che l’attività ChE potrebbe non essere uno strumento sensibile per misurare le miscele delle suddette sostanze chimiche nell’ambiente marino.