Utilisation in vitro de huit agents chimiothérapeutiques
Des cellules isogéniques DT40 de type sauvage dérivées d’un seul clone cellulaire ont été traitées avec huit différents agents cytotoxiques courants représentant chacune des principales classes de chimiothérapeutiques du cancer. Les agents sont énumérés dans le tableau 1. Pour sélectionner une concentration de traitement, nous avons mesuré la sensibilité des cellules DT40 à chaque médicament en utilisant un test de survie clonogénique (Fig. 1a). Nous avons choisi des conditions de traitement proches de la concentration IC50 de chaque médicament qui n’induisent qu’une mort cellulaire modérée, avec 30 à 85 % des cellules survivantes, afin d’éviter de sélectionner des clones résistants qui pourraient se comporter différemment lors des cycles de traitement suivants en raison de changements potentiels, par exemple, dans le transport des médicaments ou la réparation de l’ADN. Pour les cellules survivantes, les traitements ont été répétés une fois par semaine pendant quatre cycles, imitant ainsi les régimes de chimiothérapie du cancer et augmentant les chances d’induire des mutations (figure 1b). Une comparaison de la sensibilité au cisplatine de plusieurs clones post-traitement avec le clone de départ montre que ce régime de traitement modéré n’a pas provoqué de sélection significative pour la résistance (Fig. 1c).
Traitements cytotoxiques. a Test de survie des colonies de cellules DT40 traitées avec les médicaments cytotoxiques indiqués pendant 1 h (cisplatine, cyclophosphamide) ou 24 h. La concentration choisie pour les tests de mutagenèse est indiquée par des flèches noires. b Schéma du test de mutagenèse. L’ADN génomique a été séquencé à partir du clone cellulaire de départ avant traitement et de trois clones cellulaires après traitement. c Comparaison de la sensibilité au cisplatine du clone de départ (noir) et des clones isolés après quatre cycles de traitement au cisplatine (rouge). La moyenne et le SEM de trois mesures sont indiqués
L’un des médicaments testés, le cyclophosphamide, subit une activation par hydroxylation par les enzymes du cytochrome P450 . Bien que l’on pense que cette activation a lieu principalement dans le foie pendant le traitement thérapeutique, il a également été démontré que les lymphocytes expriment les enzymes nécessaires à l’activation du cyclophosphamide . Par conséquent, en raison de l’instabilité et de la disponibilité limitée du métabolite actif 4-hydroxycyclophosphamide, le cyclophosphamide a été ajouté aux cellules sous sa forme pro-drogue. Le cisplatine et le cyclophosphamide, les deux médicaments connus pour former des adduits de l’ADN, ont été ajoutés pendant 1 h, en partant du principe que leur effet destructeur sur l’ADN devrait être largement indépendant de la phase du cycle cellulaire. Les autres médicaments ont été utilisés dans des traitements de 24 heures. Cette durée correspond à deux fois la longueur du cycle cellulaire DT40, ce qui garantit que chaque cellule serait affectée par le traitement indépendamment de la phase du cycle cellulaire dans laquelle les médicaments exercent leur principal effet.
Les variations nucléotidiques simples (SNV) et les courtes mutations d’insertion/délétion ont été identifiées dans trois clones cellulaires dérivés de chaque traitement à l’aide de la méthode IsoMut développée à cet effet . Cette méthode fournit des informations sur les mutations pour les génomes de trois cellules individuelles qui sont passées par le régime de traitement (Fig. 1b). En bref, nous avons comparé toutes les séquences du génome entier obtenues dans cette étude à chaque position génomique, et n’avons accepté une mutation que si elle était présente dans exactement un échantillon, satisfaisant aux critères de fréquence minimale de l’allèle muté, de couverture de l’échantillon muté et de fréquence minimale de l’allèle de référence de chaque autre échantillon. En raison du manque de disponibilité de jeux de données validés sur les SNP et les mutations par insertion ou délétion courtes (indel), cette méthode de détection des mutations donne de bien meilleurs résultats sur le génome du poulet que les autres méthodes couramment utilisées, identifiant 90 à 95 % de toutes les mutations avec pas plus de 0 à 5 SNV faussement positifs par génome .
Mutations spontanées
Après un régime de traitement fictif s’étendant sur environ 100 générations cellulaires, nous avons détecté 47 ± 20 (SD) nouveaux SNV dans trois clones post-traitement (tableau 2, fichier supplémentaire 1 : tableau S1). Il est probable que presque toutes les mutations identifiées soient réellement apparues pendant le traitement fictif, car elles ont été identifiées comme des mutations uniques parmi toutes les séquences du génome entier obtenues pour cette étude, et la même méthode de détection des mutations n’a trouvé aucun SNV unique – qui serait un faux positif – dans le clone de départ avant le traitement (tableau 2). Parmi les six substitutions de bases possibles (C > A, C > G, C > T, T > A, T > C, T > G), les transitions C > T et les transversions C > A étaient les plus fréquentes parmi les mutations spontanées (Fig. 2c, d). Le nombre de mutations observé, projeté sur le génome diploïde de 2,06 × 109 paires de bases, équivaut à environ 2,3 × 10-10 mutations par base et par division cellulaire. Lorsque les mutations sont considérées dans le contexte des bases voisines, et que le » spectre de mutation triplet » spontané est normalisé à la fréquence d’occurrence génomique de chaque triplet, il apparaît que les mutations NCG > NTG sont les plus fréquentes, vraisemblablement en raison des substitutions de bases C > T au niveau des séquences CpG méthylées . Nous avons calculé que les mutations NCG > NTG étaient 15× plus fréquentes que le taux de mutation moyen. Les spectres de triplets non normalisés sont présentés dans le fichier supplémentaire 2 : Figure S1.
Nombre et spectre des SNV induits par le traitement. a Nombre moyen de SNV observés par génome après le régime de traitement décrit avec les médicaments indiqués. Les barres d’erreur indiquent le SEM. b Spectre de substitution de base des mutations survenues à la suite du traitement fictif, ainsi que des traitements au cisplatine et au cyclophosphamide. c Le nombre moyen de mutations par échantillon et le spectre de substitution de base des traitements indiqués. Les différences significatives par rapport au traitement fictif (p <0,05, test t de Student) sont indiquées par un astérisque. d Spectres de mutation triplet des traitements fictifs, du cisplatine et du cyclophosphamide. La base centrale de chaque triplet, listée en bas, a muté comme indiqué en haut du panneau. Le nombre de mutations de chaque type a été normalisé à la fréquence d’occurrence de ce triplet de bases dans le génome du poulet, et les taux de mutation résultants sont indiqués
Le cisplatine induit des substitutions de bases et des indels courts
Le cisplatine a induit le plus grand nombre de SNV parmi les huit médicaments testés (figure 2a). Nous avons effectué une analyse détaillée des mutations induites par le cisplatine afin de mieux comprendre les mécanismes mutagènes. Nous avons détecté 812 ± 193 SNV par clone post-traitement séquencé. Les transversions C/G > A/T étaient les plus courantes, représentant 57 % de tous les SNV, mais les six classes de substitutions de bases ont toutes été multipliées au moins par quatre (Fig. 2b). En examinant les SNV induits par le cisplatine dans le contexte des bases voisines, il apparaît que les mutations NCC > NAC sont les plus courantes, représentant 40 % de tous les cas de SNV. D’autres modifications communes sont NCT > NAT et NTC > NAC, apparaissant dans 12 % et 9 % des cas de SNV (Fig. 2d, Additional file 2 : Figure S1 et Figure S3 et Fichier complémentaire 1 : Tableau S2). Comme l’écrasante majorité des lésions de l’ADN induites par le cisplatine sont des liaisons transversales intrastrand entre purines voisines, ces trois types de SNV pourraient représenter des mutations opposées à la base 3′ des dinucléotides GG, AG et GA réticulés, respectivement. Dans le cas des liaisons transversales intrastrand GG et AG, ces mutations résultent de l’incorporation incorrecte d’une adénosine en face de la base 3′ G de la lésion (Fig. 3c). Cependant, les liaisons croisées GA n’ont pas été observées dans les rapports ci-dessus. Par conséquent, nous avons catalogué les bases entourant les 211 mutations TC > AC (GA > GT) observées, et a constaté que 159 incidences se produisaient au niveau des séquences TCC > ACC ou TCT > ACT, ce qui suggère que la paire de bases adjacente en 3′ à une réticulation intrastrand GG ou AG peut également muter. Parmi les 52 mutations restantes, dix se sont produites à la base 5′ de réticulations AG potentielles au niveau des séquences CTC > CAC, mais dans les cas restants, le seul site potentiel pour une réticulation bipurine est à GA (fichier supplémentaire 2 : figure S2). Nous concluons que le cisplatine induit des lésions mutagènes au niveau des dinucléotides GA, où les lésions peuvent être des réticulations ou des monoadduits GA intrastrand jusqu’ici non observés. Pour compléter l’analyse des mutations mononucléotidiques induites par le cisplatine, nous notons un enrichissement des changements de bases CCA > CAA et CTN > CAN, suggérant une mauvaise incorporation d’adénosine en face de la base 5′ des dinucléotides GG ou AG réticulés.
Espacement des mutations SNV, mutations dinucléotidiques et mécanismes proposés des mutations mono- et dinucléotidiques. a La distance de chaque mutation SNV par rapport au SNV précédent sur le même chromosome est tracée en fonction de la position génomique de la mutation. Les lignes pointillées fines indiquent les limites des chromosomes. Les chromosomes sont représentés par ordre numérique ; le chromosome Z est représenté en dernier à droite. La couleur de chaque point illustre le type de mutation selon la clé située au bas du panneau. Les mutations dont la distance d’intermutation est de un font partie des mutations dinucléotidiques. Un clone séquencé de chaque est représenté. b Analyse de la séquence des 183 mutations dinucléotidiques détectées après le traitement au cisplatine. La modification de la base 5′ est représentée dans les lignes, tandis que la base 3′ est représentée dans les colonnes. Les mutations équivalentes sur les deux brins sont additionnées, par exemple, GG > TT est représenté comme CC > AA. Les types de mutation les plus courants sont regroupés sous le tableau et leurs séquences sont indiquées en utilisant le brin riche en purine pour faciliter l’interprétation. c Modèles schématiques du processus réplicatif pouvant générer chacune des classes les plus courantes de mutations mononucléotidiques (c) et dinucléotidiques (d) induites par le cisplatine. Les liaisons transversales intrastrand putatives sont marquées, la lésion incertaine au niveau des séquences GA mutées est indiquée par un point d’interrogation. L’appariement non canonique des bases est indiqué par un symbole en zigzag. La contribution de chaque classe de mutation au nombre total de SNV observés est indiquée
En accord avec la découverte de mutations (de la pyrimidine à l’adénine) à travers les bases 3′ et 5′ des lésions intrastrand putatives de cisplatine réticulées, nous avons également détecté 61 ± 21 mutations dinucléotidiques par échantillon (Fig. 3a, Additional file 1 : Table S3). Soixante-quinze pour cent de ces mutations ont été trouvées au niveau des dinucléotides AG, GG ou GA. Il est intéressant de noter que ceux-ci se sont transformés en une gamme de séquences, équivalente à l’incorporation des dinucléotides AA, AT, AC et AG à l’opposé de la réticulation intrastrand putative (Fig. 3d). Une autre classe de mutation dinucléotidique commune était CA > AC et 18 des 20 cas ont été trouvés sur des séquences CCA. Sur le brin opposé, ces mutations TGG > GTG pourraient indiquer des changements de base dans la position 5′ des liaisons transversales GG. La classification des différentes mutations dinucléotidiques est présentée sur la figure 3b.
Ensemble, nous avons observé des mutations de substitution de base à la position 5′ et à la position 3′, ainsi qu’à la position précédente et à la position suivante des liaisons croisées intrastrand putatives. Le séquençage du résultat répété d’une réticulation GG dans un plasmide navette n’a fourni que des preuves suffisantes de mutations à la position 3′ et le nombre de mutations détectées chez les vers C. elegans traités au cisplatine a permis de détecter les mêmes mutations, ainsi que des mutations dinucléotidiques aux réticulations AG probables . Nos données à haute résolution indiquent une mutagenèse à chaque position d’un tronçon de 4 paires de bases centré sur les lésions GG et AG réticulées.
Les liaisons transversales interstrand induites par la cisplatine se forment au niveau des séquences GC , qui ne peuvent être présentes dans les données du spectre triplet que sous la forme de GCN. En supposant que, par analogie avec les mutations observées au niveau des réticulations intrastrand putatives, la cause la plus fréquente des mutations au niveau des lésions de réticulation interstrand serait une mauvaise incorporation d’adénosine à l’opposé du G réticulé central, ces mutations devraient se présenter comme des changements GCN > GAN. Certains de ces changements de triplets de bases ont déjà été comptés ci-dessus comme des mutations potentielles induites par la réticulation intrastrand. Seule la combinaison GCG > GAG n’a pas pu se produire au site d’une réticulation intrastrand, car GCG ne contient aucune purine voisine. Ces mutations sont très rares (0,2 % de tous les SNV) après un traitement au cisplatine. En conclusion, nos données ne montrent pas de preuves solides de mutations ponctuelles induites par les adduits de réticulation interstrand du cisplatine.
Le traitement au cisplatine a également induit un nombre remarquable de courtes mutations d’insertion et de délétion, totalisant 132 ± 34 par échantillon (figure 4a, tableau 2, fichier supplémentaire 1 : tableau S1). Les insertions étaient presque exclusivement d’une seule base (95 % de toutes les insertions, Fig. 4b). Nous avons classé les insertions d’une base en fonction de leur contexte de séquence (Fig. 4c, Fichier complémentaire 1 : Tableau S4). Quatre-vingt-quatorze pour cent des insertions d’une base étaient des paires de bases A/T. Sur le brin avec le thym, les paires de bases A/T sont les plus longues. Sur le brin avec l’insertion de thymidine, les deux bases précédentes étaient GG dans 81 % des cas, représentant vraisemblablement le site d’une réticulation intrastrand. De manière surprenante, les bases suivant le site d’insertion ont également montré une forte préférence de séquence. La première base suivant une insertion de thymidine était à 84 % T, tandis que les deux premières bases ensemble étaient à 51 % TT. Si le processus mutagène est une synthèse d’ADN utilisant le brin endommagé comme matrice, nous pouvons conclure qu’il insère de préférence une adénosine supplémentaire lorsque les bases 3′ de la réticulation GG de la matrice sont des thymines (voir Fig. 4e pour un modèle). Six des huit insertions de paires de bases C/G observées se sont produites sur des sites CC/GG (Fig. 4c), également des sites probables de liaisons croisées intrastrand.
Les insertions et les délétions induites par le cisplatine. a Le nombre moyen d’insertions (bleu) et de délétions (rouge) observées par génome après le régime de traitement décrit avec les médicaments indiqués. Les barres d’erreur indiquent le SEM. b Distribution de la longueur des insertions et délétions induites par le cisplatine. c Carte thermique de la fréquence des insertions d’une base, classées selon les deux bases précédentes et suivantes comme indiqué. La base insérée est indiquée sous chaque panneau. Les mutations équivalentes sur les deux brins sont ajoutées et indiquées comme des insertions T ou C. d Tableau et carte thermique de la fréquence des délétions d’une base, classées selon la base précédente et la base suivante comme indiqué. Les mutations équivalentes sur les deux brins sont ajoutées et représentées comme des délétions T ou C, indiquées à droite. e Modèle schématique de la génération des insertions GGTT > GGTTT les plus courantes pendant la réplication de l’ADN. L’ADN polymérase entrante (flèche grise) insère des adénosines en face des bases thymiques, puis elle insère une adénosine supplémentaire en rencontrant la réticulation intrastrand GG induite par le cisplatine. f Contexte de la séquence des délétions d’une base les plus courantes montrées sur le brin riche en purine, avec la position des réticulations intrastrand putatives indiquées au-dessus de la séquence
Soixante-treize pour cent des délétions induites par le cisplatine étaient d’une paire de bases. Une classification des délétions d’une paire de bases basée sur la base supprimée et les deux bases voisines montre que les délétions les plus courantes affectaient les motifs de séquence GG ou AG, qui peuvent être des sites de liaisons croisées intrastrand (Fig. 4d, f, fichier additionnel 1 : tableau S4). Dans le cas de AG, sur la base des délétions AGC > AC et CAG > CG, il est possible de conclure que la paire de bases 3′ ou 5′ d’un dinucléotide AG réticulé putatif peut être supprimée. En accord avec cela, 40 des 59 (68 %) délétions à deux bases observées ont supprimé les deux paires de bases des réticulations intrastrand AG ou GG putatives (fichier supplémentaire 2 : figure S4).
Le cyclophosphamide provoque principalement des mutations T > A et C > T
Le cyclophosphamide a induit 254 ± 50 mutations par substitution de base, soit plus de cinq fois plus que le traitement simulé (p = 0,025, test t de Student). Les mutations de base les plus courantes étaient T > A et C > T, suivies d’une augmentation plus modeste du nombre de mutations T > C et T > G (Fig. 2b). Il a été démontré que le cyclophosphamide induit une gamme d’adduits dans les proportions suivantes : N7-guanine monoadduits (22 %), adduits réticulés (6-12 %) et adduits phosphotriester (67 %) . Les monoadduits de N7-guanine ou les liaisons croisées inter-brins G-G peuvent expliquer les lésions C > T. Pour rechercher des preuves d’adduits réticulés, dont les plus courants ont été observés en tant qu’adduits interstrand entre les guanines au niveau des séquences GNC, nous avons recherché des préférences de séquence deux bases en amont des cytosines mutées (fichier additionnel 2 : figure S3), mais nous n’avons pas pu trouver de preuves solides pour de tels changements. Les mutations prévalentes T > A, ainsi que les mutations plus rares T > C et T > G, se produisent de préférence au centre des triplets NTT, avec une certaine préférence supplémentaire pour CTT et TTT (Fig. 2d). Il est peu probable que ces mutations soient causées par des adduits de guanine et elles pourraient plutôt être dues à des adduits de phosphotriester. Les distances d’intermutation ont indiqué peu de mutations dinucléotidiques ou d’autres regroupements de mutations (figure 3a). Il n’y avait pas de regroupement de mutations lors de la comparaison de différents clones traités dans le cas du cisplatine ou du cyclophosphamide, ce qui suggère l’absence de points chauds de mutation et la distribution largement aléatoire des SNV (fichier supplémentaire 2 : figure S5).
Contrairement au cisplatine, le traitement au cyclophosphamide n’a pas entraîné une augmentation significative du nombre de mutations d’insertion ou de délétion (Fig. 4a).
Le traitement par l’étoposide élève la fréquence de substitution des bases
Six autres médicaments ont été étudiés pour leur potentiel mutagène : les antimétabolites hydroxyurée, gemcitabine et 5-fluorouracile, plus l’inhibiteur de la topoisomérase II étoposide, l’anthracycline doxorubicine et l’agent anti-microtubules paclitaxel. Une comparaison du nombre total de SNV pour le traitement fictif plus ces six traitements par ANOVA a révélé une différence significative (p = 0,025). En effet, l’étoposide a induit plus de deux fois le nombre de mutations que le traitement fictif, ce qui constitue une différence significative par paire (p = 0,017, test t de Student). Chaque catégorie de substitution de base a augmenté, ce qui n’a pas entraîné de changement majeur dans le spectre global des mutations (figure 2c). Contrairement aux SNV, le nombre d’indels n’était pas significativement élevé par rapport au traitement simulé (figure 4a).
Aucun effet mutagène détectable de l’hydroxyurée, de la gemcitabine, du 5-fluorouracile, de la doxorubicine et du paclitaxel
Les traitements de vingt-quatre heures avec l’hydroxyurée, la gemcitabine, le 5-fluorouracile, la doxorubicine et le paclitaxel n’ont pas induit un nombre significatif de SNV ou d’indels supplémentaires par rapport au traitement fictif (Figs 2a, 4a, analyse ANOVA). Ces traitements n’ont pas non plus modifié le spectre des mutations SNV spontanées (Fig. 2c). De plus, aucun des agents testés, y compris le cisplatine, le cyclophosphamide et l’étoposide, n’a induit d’indels plus importants (plus de 100 pb) ou d’événements de réarrangement du génome, à l’exception d’une délétion de 3453 pb dans un clone traité à l’étoposide.
En conclusion, à des concentrations qui tuent une proportion modérée de cellules en culture, aucun des agents hydroxyurée, gemcitabine, 5-fluorouracil, doxorubicine ou paclitaxel n’a induit de mutagenèse génomique mesurable. En revanche, dans le même essai, le cisplatine et le cyclophosphamide ont induit un grand nombre de mutations avec des spectres de mutation distincts, tandis que le traitement à l’étoposide a entraîné une mutagenèse par substitution de base marginalement élevée.
La baisse des taux de mutagenèse dans les gènes fournit la preuve de taux de réparation distincts
Les mutations induites par la chimiothérapie ont le potentiel d’altérer la fonction des gènes et de contribuer ainsi au développement de la résistance ou de tumeurs secondaires. Pour mesurer l’importance de cet effet, nous avons cartographié les SNVs induits par le cisplatine et le cyclophosphamide par rapport aux séquences génétiques. Un total de 44,2 % du génome du poulet est annoté pour coder des transcriptions primaires dans la version du génome Galgal4.82. Il est intéressant de noter qu’une plus petite proportion de mutations induites par le traitement est apparue au niveau des gènes (34,7 % et 35,1 %) que ce que l’on attendait d’une distribution uniforme (Fig. 5a). Par rapport à une distribution génomique uniforme, les mutations sont 17 % plus susceptibles de se produire dans les régions intergéniques, tandis qu’elles sont 22 % sous-représentées dans les régions géniques. L’explication la plus probable de la réduction hautement significative du nombre de SNV au niveau des gènes par rapport aux régions intergéniques (p <0,001 dans le cas du cisplatine et du cyclophosphamide, test χ2) est l’activité de la réparation couplée à la transcription (TCR), qui peut éliminer les lésions simple brin sans erreur . Nous avons utilisé un ensemble de données RNA-seq provenant de la lignée cellulaire DT40 pour demander si le niveau d’expression des gènes influence la densité de mutation, comme prévu s’il est influencé par la TCR. En effet, nous avons constaté que la distribution des gènes mutés est biaisée vers une faible expression (Fig. 5b), ce qui suggère que la réparation sans erreur des lésions est plus efficace dans les gènes fortement exprimés. De plus, des mutations hautement significatives (p <0,001, test χ2) de biais de brin de C > A induit par le cisplatine et de C > T induit par le cyclophosphamide dans les gènes indiquent spécifiquement une réparation efficace des adduits de guanine dans le brin transcrit par le TCR (Fig. 5c).
Densité de mutation par rapport à la transcription des gènes. a La proportion de régions génomiques classées comme intergéniques (vert) ou géniques (rouge) sur la base de l’annotation génomique Ensemblome, indiquée à gauche, diffère de la proportion de SNV induits par le cisplatine ou le cyclophosphamide trouvés dans les régions respectives (colonnes du milieu et de droite). b La distribution du niveau d’expression de tous les gènes, sur la base des données de couverture RNA-Seq (vert) est indiquée par rapport à la distribution du niveau d’expression des gènes contenant des SNV induits par le cisplatine ou le cyclophosphamide (rouge). Les niveaux d’expression sont indiqués en log10 des valeurs FPKM (fragments par kilobase de transcription par million de lectures mappées). c Biais de brin des mutations géniques induites par le cisplatine (à gauche) ou le cyclophosphamide (à droite). Différences hautement significatives (p <0.001, test χ2) les différences entre les brins non transcrits et transcrits sont indiquées par des doubles astérisques
Corrélation des schémas mutationnels identifiés avec les signatures mutationnelles dans le cancer humain
Nous avons comparé les différents schémas mutationnels induits par les traitements aux signatures mutationnelles identifiées dans le cancer humain (signatures COSMIC) . Le spectre normalisé des triplets du traitement fictif présentait une bonne similitude visuelle avec la signature 1 associée au vieillissement (figure 1d) en raison de la présence de mutations CG > TG. Cependant, cela n’a pas été confirmé par l’analyse de corrélation de Pearson (Fig. 6a), car dans nos échantillons traités par simulation, il existe une gamme de types de mutation en plus des mutations CG > TG surreprésentées de 15 fois, alors que la signature 1 ne contient essentiellement aucun autre type de mutation. La signature 5 à large spectre est également associée au vieillissement et nous avons observé une corrélation positive entre cette signature et plusieurs traitements qui n’ont pas modifié le profil de mutation spontanée (Fig. 6a). En accord avec la dominance des processus mutationnels liés au vieillissement, les profils mutationnels de tous les traitements, à l’exception du cisplatine et du cyclophosphamide, montrent une bonne corrélation par paire (Fig. 6b). Les mutations induites par le cisplatine sont bien corrélées avec la signature 4 spécifique au tabagisme et la signature 24 induite par l’aflatoxine (Fig. 6a), ce qui suggère que ces agents provoquent des mutations par des mécanismes similaires. En effet, les trois génotoxines forment toutes des adduits volumineux aux guanines N7, qui sont générés par les hydrocarbures aromatiques polycycliques dans le cas de la fumée de cigarette. Enfin, les mutations induites par le cyclophosphamide ne présentent qu’une faible corrélation avec la rare signature 25 d’étiologie inconnue (Fig. 6a). Ces résultats démontrent que si l’analyse de la mutagenèse dans les lignées cellulaires peut modéliser les processus mutationnels observés dans le cancer, comme le prouvent également le séquençage de l’exome de cellules de souris et d’humains traités par mutagenèse et le séquençage du génome entier de clones individuels de fibroblastes embryonnaires de souris , il est peu probable que les mutations induites par le traitement au cisplatine ou au cyclophosphamide contribuent de manière significative aux signatures COSMIC.
Corrélation des modèles de mutation induits par les médicaments avec les signatures de mutation identifiées dans le cancer. a Carte thermique du coefficient de corrélation de Pearson entre les modèles de mutation de base triplet induits par le traitement cytotoxique ajusté aux fréquences de triplet humain (lignes) et les 30 signatures mutationnelles confirmées identifiées dans le cancer humain . La clé de la carte thermique est présentée en bas, avec un histogramme superposé indiquant le nombre de cellules dans chaque plage de valeurs. b Carte thermique montrant les coefficients de corrélation de Pearson entre chaque paire de modèles mutationnels induits par le traitement
La chimiothérapie mutagène peut induire une résistance par l’inversion génétique des gènes mutés
La chimiothérapie mutagène peut avoir des conséquences très importantes si les mutations induites contribuent à l’évolution subclonale de la résistance au traitement dans les cellules survivantes. Nous avons cherché des preuves d’un tel processus parmi les mutations documentées qui restaurent la fonctionnalité des gènes BRCA1 ou BRCA2 mutés . Parmi les sept mutations de décalage de cadre observées pour restaurer la fonction du gène BRCA2 et provoquer une résistance après le traitement au cisplatine des cellules Capan-1 qui portent une délétion d’une seule base dans BRCA2 , nous avons trouvé deux cas d’insertions GGT > GGTT, qui est de loin la séquence la plus courante des insertions induites par le cisplatine (figure 4c). Ces insertions, 18 pb en aval de la paire de bases supprimée, ont restauré le cadre de lecture, le niveau de protéine et la fonction de BRCA2 . Dans une étude distincte, une mutation non-sens dans BRCA2 est devenue inactivée par un SNV TAG > TAT dans un adénocarcinome ovarien traité au cisplatine suite à une rechute résistante au cisplatine. Dans la lignée cellulaire PEO1 établie à partir de la tumeur avant l’émergence de la résistance au cisplatine, la sélection du cisplatine a conduit à des mutations TAG > TTG du codon stop dans huit clones résistants sur huit qui ont restauré la protéine BRCA2 . Nos résultats montrent que la mutation de l’une ou l’autre base en thymine au niveau des liaisons transversales intrastrand putatives AG est une conséquence courante du traitement au cisplatine, les mutations CT > AT (AG > AT) et CT > CA (AG > TG) représentant respectivement 12 % et 7 % de tous les SNV induits par le cisplatine (Fig. 2d). La découverte de ces insertions et SNV nouvellement identifiés induits par le cisplatine dans les révertants BRCA2 émergeant in vivo et in vitro suggère très fortement que la thérapie peut induire directement des mutations causant la résistance.
Nous avons tenté de calculer une estimation de la probabilité que les mutations induites par les médicaments génèrent les changements génétiques exacts nécessaires pour inverser les mutations de décalage de cadre ou de non-sens. Si un décalage de cadre réversible doit se produire dans un rayon de 20 paires de bases de la mutation d’origine et qu’un SNV doit modifier l’une des trois bases d’un codon stop, alors 108 indels placés au hasard, ou 7 × 108 SNV, seraient nécessaires pour que la mutation requise ait 50 % de chances de se produire dans le génome humain. Notre régime expérimental de traitement au cisplatine en quatre cycles a induit environ 130 indels et 800 SNV par Gb. Si un régime de traitement clinique avait le même effet mutagène, il faudrait moins d’un million de cellules tumorales traitées survivantes pour avoir 50 % de chances que le traitement induise la réversion d’un décalage de cadre ou la suppression d’une mutation non sens. Bien que reposant en partie sur des chiffres spéculatifs, nos approximations suggèrent que l’effet des traitements mutagènes contribue probablement à l’évolution de la résistance aux médicaments par l’initiation de mutations de novo et d’indels dans les sous-clones de cancer.