Etudes de cartographie du destin
Identifier les origines cellulaires des tissus en régénération est une question fondamentale en biologie de la régénération. Plusieurs études ont réalisé des analyses de cartographie du destin pour étudier la ou les origines cellulaires du muscle cardiaque pendant la régénération cardiaque chez le poisson zèbre. En utilisant des techniques de cartographie du destin génétique inductible (Buckingham et Meilhac, 2011), deux études ont directement examiné la contribution des cardiomyocytes au cœur régénéré du poisson zèbre (Jopling et al., 2010 ; Kikuchi et al., 2010). Dans les deux cas, deux lignées transgéniques ont été utilisées : une lignée porte un gène Cre recombinase (CreER) inductible par le 4-hydroxytamoxifène (4-HT) dont l’expression est pilotée dans les cardiomyocytes par le promoteur du gène de la chaîne légère de myosine cardiaque 2 (cmlc2), également appelé gène de la chaîne légère de myosine 7 (myl7) ; et l’autre est une lignée indicatrice dans laquelle l’expression du rapporteur de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) peut être induite dans les cellules exprimant CreER après excision de la cassette d’arrêt transcriptionnel flanquée de loxP par des traitements à la 4-HT (Jopling et al., 2010 ; Kikuchi et al., 2010). Grâce à ce système, presque tous les cardiomyocytes exprimant cmlc2 ont été pré-marqués avec EGFP par des traitements à la 4-HT avant la blessure, et des expériences de régénération ont été réalisées 30 jours après la résection ventriculaire. Les résultats des deux études ont clairement montré que la grande majorité du myocarde régénéré est marqué par l’EGFP, sans qu’aucune différence significative ne soit détectée dans la proportion de cardiomyocytes EGFP+ dans le tissu régénéré par rapport aux ventricules non blessés, ce qui indique que les cardiomyocytes cmlc2+ existants, mais pas les non-myocytes cmlc2-, sont la principale source de nouveaux muscles pendant la régénération cardiaque du poisson zèbre.
Il a été démontré précédemment que les cellules dérivées de l’épicarde (EPDC) contribuent à la vascularisation et la régulent pendant la régénération cardiaque chez le poisson zèbre (Kim et al, 2010 ; Lepilina et al., 2006) ; cependant, leur contribution à la régénération du myocarde n’a pas été directement testée. Des études récentes ont abordé cette question en utilisant deux approches différentes : la cartographie génétique du destin (Kikuchi et al., 2011a) et la transplantation (González-Rosa et al., 2012). Dans l’étude de cartographie génétique inductible du destin, les séquences cis-régulatrices du facteur de transcription 21 (tcf21), également connu sous le nom d’Epicardin (Robb et al., 1998), Pod1 (Quaggin et al., 1999), Capsulin (Hidai et al., 1998 ; Lu et al, 1998), ont été utilisés pour cibler CreER sur l’épicarde du poisson zèbre (Serluca, 2008), et sa progéniture a été suivie pendant la régénération après un marquage dépendant de CreER avec EGFP, qui a été induit à partir d’une lignée indicatrice avec un traitement transitoire par 4-HT. Dans l’essai de transplantation, un morceau de tissu cardiaque a été prélevé dans le ventricule lésé de la souche β-actine:EGFP, dans lequel la plupart des cellules cardiaques, y compris les cellules épicardiques, ont été marquées par l’EGFP, et transplanté dans un cœur de type sauvage fraîchement lésé qui avait été irradié avant la blessure pour supprimer la prolifération des cellules dans le tissu receveur. Dans les deux études, de nombreuses cellules marquées au sort ont été détectées dans le régénéré et caractérisées histologiquement comme des myofibroblastes (González-Rosa et al., 2012) et des cellules périvasculaires (González-Rosa et al., 2012 ; Kikuchi et al., 2011a), mais pas comme des cardiomyocytes (González-Rosa et al., 2012 ; Kikuchi et al., 2011a). Ces résultats indiquent que l’épicarde ou les EPDC ne donnent pas naissance au muscle cardiaque pendant la régénération cardiaque du poisson zèbre, ce qui est cohérent avec la constatation que les cardiomyocytes sont la source principale du myocarde en régénération.
Les expériences de traçage de lignée décrites ci-dessus n’ont pas abordé la question de savoir si la population cmlc2+ comprend plusieurs types de cellules musculaires qui peuvent contribuer différemment à la régénération. Récemment, Poss et ses collègues ont généré un système transgénique qui permet un marquage clonal multicolore des cardiomyocytes et a défini des lignées myocardiques précédemment non caractérisées, tout en révélant leurs comportements au cours de la morphogenèse du cœur du poisson zèbre (Gupta et Poss, 2012). Ce système se compose de deux allèles transgéniques, cmlc2:CreER (Kikuchi et al., 2010) et d’une cassette rapporteuse multicolore appelée priZm, qui a été construite en utilisant la technologie Brainbow développée à l’origine pour visualiser les neurones individuels et les connexions dans le cerveau de la souris (Livet et al., 2007) (Fig. 1A). Grâce à ce système, les auteurs ont induit un marquage clonal multicolore à 2 jours après la fécondation, et ont réalisé des analyses d’images à différents stades de développement pour caractériser en détail le comportement des clones de cardiomyocytes pendant la morphogenèse du cœur.
Figure 1. Nouvelles sources cellulaires pour le muscle cardiaque. (A) Un système transgénique pour le marquage clonal multicolore des cardiomyocytes. La cassette priZm exprime une protéine rapporteur fluorescente rouge (RFP) comme couleur par défaut sous le contrôle du promoteur de la β-actine2. La recombinaison différentielle entre les sites appariés lox2272 (triangle noir) ou loxP (triangle blanc) induit l’expression de la protéine fluorescente cyan (CFP) ou de la protéine fluorescente jaune (YFP), respectivement. La souche transgénique priZm porte des insertions en tandem multicopies de la cassette indiquée à un locus génétique unique, et des événements d’excision limités médiés par Cre aux sites loxP ou lox2272 produisent de nombreuses couleurs permanentes possibles avec diverses combinaisons d’expression RFP, CFP et YFP. Cette stratégie permet un marquage clonal multicolore des cardiomyocytes dans le contexte de la double transgénèse avec la souche cmlc2:CreER (Kikuchi et al., 2010) après des traitements au tamoxifène (Gupta et Poss, 2012). (B) Lignées musculaires dans le ventricule du poisson zèbre. Tr, muscle trabéculaire ; Pr, muscle primordial. (C) Régénération des cellules musculaires primordiales et corticales. Les flèches et les pointes de flèche dans les panneaux du milieu et de droite indiquent le bord des clones migrateurs de la couche musculaire primordiale et la paroi ventriculaire réparée par la couche musculaire corticale, respectivement. Ligne pointillée : plan d’amputation. Cette figure est un résumé des travaux de Poss et de ses collègues (Gupta et Poss, 2012).
Le ventricule du poisson zèbre a été reconnu comme contenant deux types de muscles cardiaques, comprenant une paroi périphérique appelée couche compacte et une couche trabéculaire interne (Hu et al., 2001). Il a été démontré que la formation des trabécules se produit par la délamination des cardiomyocytes de la paroi musculaire ventriculaire (Liu et al., 2010). L’approche de marquage clonal décrite ci-dessus a affiné cette compréhension anatomique et développementale du cœur du poisson zèbre. Tout d’abord, les auteurs ont constaté que la paroi musculaire externe du tube cardiaque embryonnaire persiste même dans le ventricule adulte. Pour tenir compte de la croissance cardiaque, cette couche musculaire ne s’étend que de manière circonférentielle tout au long de la vie du poisson, maintenant une épaisseur d’un seul cardiomyocyte comme on le voit dans le cœur embryonnaire. Cette lignée musculaire, appelée muscle primordial, persiste pour former la couche la plus interne de la paroi musculaire périphérique du ventricule adulte (Fig. 1B, panneau de droite). Deuxièmement, les auteurs ont observé qu’au stade juvénile, la couche musculaire primordiale est pénétrée par quelques clones de cardiomyocytes trabéculaires – ~ 8 clones par ventricule – comme des événements rares et spatialement séparés, et ces clones de cardiomyocytes dominants se développent sur toute la couche primordiale, créant une autre paroi musculaire qui constitue la couche la plus externe de la paroi musculaire périphérique du ventricule adulte (Fig. 1B). Cette lignée musculaire est clairement distincte des lignées musculaires trabéculaire et primordiale, et a été appelée la couche musculaire corticale. Ainsi, dans la vue affinée, le ventricule du poisson zèbre adulte est constitué de trois lignées musculaires différentes, le muscle primordial, le trabéculaire et le cortical, et ces lignées se développent dans cette séquence temporelle au cours du développement (Gupta et Poss, 2012).
Après la définition des lignées musculaires distinctes, une question intéressante à poser est de savoir si ces lignées contribuent de manière différentielle à la régénération cardiaque. Les auteurs ont réalisé des expériences de régénération en utilisant des ventricules de poissons adultes cmlc2:CreER ; priZm chez lesquels un marquage clonal multicolore avait été induit à un stade embryonnaire comme décrit ci-dessus. 14 jours après la blessure, les clones de muscles corticaux adjacents à la blessure se sont développés dans les directions latérales et radiales dans le site de la blessure, mais l’intégration des cellules musculaires primordiales n’a pas eu lieu à ce moment-là (Fig. 1C, panneau central). 30 jours après la blessure, alors que le muscle cortical reconstruisait la paroi musculaire, des clones de la couche musculaire primordiale sont devenus détectables dans le régénéré, et une couche primordiale complète a été restaurée, formant une limite de couche cellulaire unique entre le muscle trabéculaire et le muscle cortical régénéré 60 jours après le traumatisme (Fig. 1C, panneau de droite). Ainsi, les couches musculaires primordiales et corticales contribuent toutes deux à la régénération, mais elles se forment dans un ordre inverse par rapport à la séquence du développement normal. Le muscle primordial ne s’étend que de manière circonférentielle, comme observé au cours de la morphogenèse cardiaque, tandis que le muscle cortical s’étend de manière moins restreinte et contribue à la plus grande masse de la nouvelle paroi ventriculaire. Ce résultat est cohérent avec l’observation précédente selon laquelle le muscle régénéré dans les cœurs amputés est principalement dérivé d’une sous-population de myocytes dans la paroi latérale du ventricule dans laquelle le facteur de transcription cardiogénique gata4 est activé (Kikuchi et al…, 2010).
Plus récemment, le même groupe a effectué des analyses clonales multicolores similaires sur des cellules musculaires corticales gata4+ et cmlc2+ avec un marquage induit au stade adulte, et ces expériences ont révélé que, contrairement à la morphogenèse ventriculaire initiale, il n’y a pas de dominance clonale dans les cellules musculaires corticales au cours de la régénération (Gupta et al., 2013), ce qui suggère que le mécanisme de prolifération utilisé par les cardiomyocytes au cours de la régénération est distinct de celui utilisé au cours du développement cardiaque.