La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique de biologie moléculaire relativement simple et largement utilisée pour amplifier et détecter des séquences d’ADN et d’ARN. Par rapport aux méthodes traditionnelles de clonage et d’amplification de l’ADN, qui peuvent souvent prendre des jours, la PCR ne nécessite que quelques heures. La PCR est très sensible et nécessite un modèle minimal pour la détection et l’amplification de séquences spécifiques. Les méthodes de base de la PCR ont encore progressé par rapport à la simple détection de l’ADN et de l’ARN. Ci-dessous, nous avons fourni un aperçu des différentes méthodes de PCR et des réactifs que nous fournissons à Enzo Life Sciences pour vos besoins de recherche. Notre objectif est d’aider les scientifiques à accéder rapidement aux réactifs PCR pour les utiliser dans leur prochain projet de recherche !
PCR
Pour une PCR standard, tout ce dont vous avez besoin est une ADN polymérase, du magnésium, des nucléotides, des amorces, la matrice d’ADN à amplifier et un thermocycleur. Le mécanisme de la PCR est aussi simple que son objectif : 1) l’ADN double brin (ADNdb) est dénaturé par la chaleur, 2) les amorces s’alignent sur les brins d’ADN simples et 3) les amorces sont allongées par l’ADN polymérase, ce qui donne deux copies du brin d’ADN original. Le processus de dénaturation, d’annexion et d’élongation sur une série de températures et de temps est connu comme un cycle d’amplification. Chaque étape du cycle doit être optimisée pour la matrice et l’ensemble d’amorces utilisées. Ce cycle est répété environ 20 à 40 fois et le produit amplifié peut alors être analysé. La PCR est largement utilisée pour amplifier l’ADN en vue d’une utilisation expérimentale ultérieure. La PCR a également des applications dans les tests génétiques ou pour la détection d’ADN pathogène.
Comme la PCR est une méthode très sensible et que de très petits volumes sont nécessaires pour des réactions uniques, la préparation d’un master mix pour plusieurs réactions est recommandée. Le master mix doit être bien mélangé, puis divisé en fonction du nombre de réactions, en s’assurant que chaque réaction contiendra la même quantité d’enzyme, de dNTP et d’amorces. De nombreux fournisseurs, comme Enzo Life Sciences, proposent également des mélanges PCR qui contiennent déjà tout, sauf les amorces et la matrice d’ADN.
Les régions riches en guanine et en cytosine (GC) représentent un défi pour les techniques PCR standard. Les séquences riches en GC sont plus stables que les séquences à plus faible teneur en GC. En outre, les séquences riches en GC ont tendance à former des structures secondaires, telles que des boucles en épingle à cheveux. Par conséquent, les doubles brins riches en GC sont difficiles à séparer complètement pendant la phase de dénaturation. Par conséquent, l’ADN polymérase ne peut pas synthétiser le nouveau brin sans entrave. Une température de dénaturation plus élevée peut améliorer ce phénomène et des ajustements vers une température de recuit plus élevée et un temps de recuit plus court peuvent empêcher la liaison non spécifique des amorces riches en GC. Des réactifs supplémentaires peuvent améliorer l’amplification des séquences riches en GC. Le DMSO, le glycérol et la bétaïne aident à perturber les structures secondaires qui sont causées par les interactions GC et facilitent ainsi la séparation des doubles brins.
PCR à démarrage rapide
L’amplification non spécifique est un problème qui peut se produire pendant la PCR. La plupart des ADN polymérases qui sont utilisées pour la PCR, fonctionnent mieux à 68 – 72°C. Par conséquent, la température d’extension choisie doit se situer dans cette fourchette. Cependant, l’enzyme peut aussi être active à un degré moindre, à des températures plus basses. À des températures bien inférieures à la température d’hybridation, les amorces ont tendance à se lier de manière non spécifique, ce qui peut entraîner une amplification non spécifique, même si la réaction est mise en place sur la glace. On peut éviter ce phénomène en utilisant des inhibiteurs de polymérase qui ne se dissocient de l’ADN polymérase qu’une fois une certaine température atteinte. L’inhibiteur peut être un anticorps qui se lie à la polymérase et se dénature à la température de dénaturation initiale.
RT-PCR
La PCR par transcription inverse, ou RT-PCR, permet d’utiliser l’ARN comme matrice. Une étape supplémentaire permet la détection et l’amplification de l’ARN. L’ARN est transcrit de manière inverse en ADN complémentaire (ADNc), à l’aide de la transcriptase inverse. La qualité et la pureté de la matrice d’ARN sont essentielles à la réussite de la RT-PCR. La première étape de la RT-PCR est la synthèse d’un hybride ADN/ARN. La transcriptase inverse a également une fonction RNase H, qui dégrade la partie ARN de l’hybride. La molécule d’ADN simple brin est ensuite complétée par l’activité ADN polymérase ADN-dépendante de la transcriptase inverse en ADNc. L’efficacité de la réaction de premier brin peut affecter le processus d’amplification. À partir de là, la procédure PCR standard est utilisée pour amplifier l’ADNc. La possibilité de transformer l’ARN en ADNc par RT-PCR présente de nombreux avantages. L’ARN est monocaténaire et très instable, ce qui le rend difficile à travailler. Le plus souvent, il sert de première étape à la qPCR, qui quantifie les transcrits d’ARN dans un échantillon biologique.
qPCR et RT-qPCR
La PCR quantitative (qPCR) est utilisée pour détecter, caractériser et quantifier les acides nucléiques pour de nombreuses applications. Généralement, dans la RT-qPCR, les transcriptions d’ARN sont quantifiées en les transcrivant d’abord en ADNc, comme décrit ci-dessus, puis la qPCR est ensuite réalisée. Comme dans la PCR standard, l’ADN est amplifié par 3 étapes répétées : dénaturation, recuit et élongation. Cependant, dans la qPCR, le marquage fluorescent permet de recueillir des données au fur et à mesure de la progression de la PCR. Cette technique présente de nombreux avantages grâce à un éventail de méthodes et de chimies disponibles.
Dans la qPCR à base de colorant (typiquement vert), le marquage fluorescent permet la quantification des molécules d’ADN amplifiées en employant l’utilisation d’un colorant de liaison à l’ADNdb. Au cours de chaque cycle, la fluorescence est mesurée. Le signal de fluorescence augmente proportionnellement à la quantité d’ADN répliqué et l’ADN est donc quantifié en « temps réel ». Les inconvénients de la qPCR à base de colorant sont qu’une seule cible peut être examinée à la fois et que le colorant se lie à tout ADN ds présent dans l’échantillon.
Dans la qPCR à base de sonde, de nombreuses cibles peuvent être détectées simultanément dans chaque échantillon mais cela nécessite l’optimisation et la conception d’une ou plusieurs sondes spécifiques à la cible, utilisées en plus des amorces. Il existe plusieurs types de conception de sondes, mais le type le plus courant est la sonde d’hydrolyse, qui intègre l’utilisation d’un fluorophore et d’un quencher. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) empêche l’émission du fluorophore via le quencher lorsque la sonde est intacte. Cependant, au cours de la réaction PCR, la sonde est hydrolysée pendant l’extension de l’amorce et l’amplification de la séquence spécifique à laquelle elle est liée. Le clivage de la sonde sépare le fluorophore du quencher et entraîne une augmentation de la fluorescence en fonction de l’amplification. Ainsi, le signal de fluorescence d’une réaction qPCR basée sur une sonde est proportionnel à la quantité de la séquence cible de la sonde présente dans l’échantillon. La qPCR à base de sonde étant plus spécifique que la qPCR à base de colorant, elle est souvent la technologie utilisée dans les tests de diagnostic par qPCR.
Plus de détails peuvent être trouvés sur notre site web : AMPIGENE® PCR & Solutions qPCR. La mission d’Enzo est de fournir des solutions peu coûteuses, facilement adaptables et efficaces au marché du diagnostic. Notre plateforme AMPIPROBE® utilise un nouveau design de PCR pour permettre la quantification d’acides nucléiques pour des cibles cliniquement pertinentes. Nos tests sont facilement adaptables pour une utilisation en laboratoire et rentables, sans compromis sur la qualité et les performances. Compatibles sur les plateformes PCR ouvertes, les tests AMPIPROBE® peuvent être validés sur les instruments existants, ce qui élimine le besoin de dépenses d’investissement.
Le tableau récapitulatif ci-dessous met en évidence les produits PCR disponibles pour la PCR, la RT-PCR et la qPCR. Veuillez cliquer sur le produit qui vous intéresse pour obtenir plus d’informations ou contacter notre équipe de support technique pour une assistance supplémentaire.
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