Imagerie
L’ultrasonographie a montré que le plan de section transversale du muscle quadriceps du patient était supérieur de 7,2 ET à la valeur moyenne (± ET) de 10 témoins appariés selon l’âge et le sexe (6,72 cm2 contre 3,13±0,49 cm2). En outre, l’épaisseur de son coussinet adipeux sous-cutané était inférieure de 2,88 ET à la valeur moyenne des témoins (0,18 cm contre 0,36±0,06 cm). Il n’y avait pas de différence significative dans le diamètre de l’os fémoral entre le patient et les témoins (0,57 cm vs. 0,50±0,13 cm). L’échogénicité du muscle était normale, sans indication de fibrose ou de dépôt de tissu graisseux (figure 1B et figure 1C).
Biologie moléculaire
Figure 2.
Figure 2. Analyse des mutations.
Le panneau A montre les résultats de l’analyse de restriction induite par amorce pour la présence de la mutation g.IVS1+5 g→a chez le patient, sa mère et un sujet témoin. AccI clive un fragment de 166 pb en deux segments – un de 135 pb et un de 31 pb – uniquement si la séquence de type sauvage est présente. Les voies 3 et 4 montrent les segments clivés (coupés) et non clivés (non coupés) d’un sujet témoin. Le panneau B montre les résultats de la PCR multiplex à transcription inverse de l’ARN messager (ARNm) du patient et de deux sujets témoins dans des cellules lymphoblastoïdes immortalisées par le virus d’Epstein-Barr. Un gène de référence (HPRT) a été amplifié avec divers fragments du gène de la myostatine et a donné un produit d’intensité égale dans toutes les réactions. Aucun produit de la myostatine n’a pu être amplifié à partir de l’ARN du patient, ce qui indique une désintégration du messager médiée par le non-sens. Le panneau C montre les produits de la PCR par transcriptase inverse générés à l’aide des amorces P2F et P4R à partir de constructions de myostatine de type sauvage (voies 1 et 2) et de constructions de myostatine mutante (voies 3 et 4) transfectées dans des cellules COS-7, avec (voies 1 et 3) et sans (voies 2 et 4) transcriptase inverse. En présence de la mutation, 68 % de l’ARNm précurseur est épissé de manière incorrecte. Le panneau D montre que la myostatine mutante présente une transition g.IVS1+5 g→a au niveau du site donneur d’épissage dans l’intron 1, ce qui fait que l’épissage se produit 108 pb en aval au niveau d’un site d’épissage cryptique, ce qui produit un transcrit plus important chez le mutant et entraîne un codon de terminaison prématuré. CMV désigne les séquences promotrices dérivées du cytomégalovirus.
Le phénotype de notre patient rappelait l’augmentation de la musculature et la diminution de l’adiposité rapportées chez les souris1,16-18 et les bovins10-13 avec des mutations de perte de fonction dans le gène de la myostatine. Nous avons donc séquencé tous les exons et les régions introniques flanquantes du gène chez le patient et sa mère. Bien qu’aucune mutation n’ait été détectée dans la région codante, une transition g→a au niveau du nucléotide g.IVS1+5 était présente dans les deux allèles du patient et dans un allèle de sa mère. La mutation a été confirmée par une analyse de restriction (figure 2A) et était absente dans 200 allèles de sujets témoins d’origine ethnique similaire, excluant ainsi un polymorphisme commun.
La présence de cette mutation a soulevé la possibilité d’un défaut d’épissage de l’ARNm précurseur de la myostatine chez le patient, car la position +5 du site donneur d’épissage est un emplacement courant pour les mutations du site d’épissage chez l’homme19. Lorsque nous avons appliqué la méthode de notation de Shapiro et Senapathy20 pour analyser le degré de correspondance entre la séquence du site donneur d’épissage de l’intron 1 et la séquence consensus correspondante (AG//gtrag), le score a chuté de 79,4 (type sauvage, GT//gtaagt) à 65,0 (mutant, GT//gtaaat), ce qui indique que le missplicing est probable.
Afin d’étudier l’effet de cette mutation sur la maturation de l’ARNm de la myostatine, nous avons généré des constructions génomiques de type sauvage et mutant pour l’expression de l’ARNm de la myostatine humaine dans des cellules musculaires et non musculaires en culture et nous avons effectué une PCR de transcription inverse sur l’ARN isolé des cellules transfectées. La PCR à travers la frontière entre l’exon 1 et l’exon 2 a donné une bande unique de 405 pb pour la construction de type sauvage. Pour la construction mutante, cependant, nous avons détecté deux produits PCR, une faible bande équivalente en taille à celle obtenue après transfection de la construction de type sauvage et un nouveau produit majeur de poids moléculaire plus élevé (Figure 2C). Ce produit contenait une insertion des 108 premiers pb de l’intron 1 (incluant la mutation g.IVS1+5 g→a) et résultait de l’activation d’un site d’épissage cryptique au sein de l’intron 1 (at//gtaagt) (Figure 2D). La quantification des intensités relatives des bandes majeures et mineures obtenues à partir de ces réactions PCR a montré que 68,8±0,032 % (trois échantillons) de l’ARNm de la myostatine provenant de la construction mutante était mal épissé (Figure 2C). L’ARNm misspliced est prédit pour donner lieu à une protéine sévèrement tronquée, puisque l’insertion de 108-bp ajoute un seul résidu lysine suivi d’un codon de terminaison prématuré.
Figure 3.
Figure 3. Résultats du Western Blotting et de l’immunoprécipitation. Panneau A montre l’absence de production de myostatine à partir de constructions génomiques mutantes de myostatine dans le milieu conditionné de cellules COS-7 transfectées de manière transitoire. Les anticorps contre le domaine C-terminal mature de la myostatine reconnaissent une bande de 12 kD à partir des constructions de type sauvage (voie 1) mais pas des constructions mutantes (voie 2). Comme contrôle, les cellules ont été co-transfectées avec une protéine étiquetée myc, qui était abondamment exprimée dans les deux populations. Le panneau B montre les résultats de l’immunoprécipitation ou de l’immunoprécipitation fictive (IP) et du transfert Western d’échantillons de sérum provenant de rats (voies 1, 2 et 3), de sujets témoins (voies 4, 5 et 6) et du patient (voie 7) avec (voies 1, 2, 4, 5, 7 et 8) ou sans (voies 3 et 6) anticorps JA-16 contre le domaine C-terminal de la myostatine comme immunoprécipitant. Le Western blot a ensuite été sondé avec des anticorps contre le propeptide de la myostatine. Une bande correspondant au propeptide de la myostatine était présente à des niveaux élevés dans le sérum de rat et, à un moindre degré, dans le sérum de sujets témoins, et était absente dans le sérum du patient.
Conformément aux résultats de l’analyse de l’ARN, la protéine myostatine a été détectée uniquement dans le milieu conditionné de cellules COS-7 transfectées avec la construction de type sauvage, alors qu’elle était pratiquement absente dans les cellules transfectées avec la construction mutante (figure 3A). Des résultats similaires ont été obtenus avec d’autres lignées cellulaires, y compris les cellules de Chinese-hamster-ovary et les cellules de rhabdomyosarcome A204 (données non présentées).
Nous avons également cherché à confirmer l’effet de cette mutation du site d’épissage dans des échantillons provenant du patient. En l’absence d’un échantillon de biopsie musculaire, nous avons examiné l’ARNm de la myostatine provenant des cellules lymphoblastoïdes immortalisées par l’EBV du patient. Ces cellules ont tendance à exprimer de faibles niveaux de transcriptions illégitimes, qui ne sont pas normalement présentes dans les cellules sanguines. La transcription illégitime passe par les promoteurs normaux et peut être utilisée pour la détection de mutations au niveau de l’ARNm si un tissu spécifique n’est pas disponible.21 Nous n’avons pas trouvé de produits de la myostatine dans les cellules du patient (Figure 2B). Nous pensons que la dégradation générale de l’ARNm est une explication peu probable de ce résultat négatif, puisque nous avons pu détecter des niveaux similaires de transcrits d’un gène de référence (HPRT) chez le patient et les témoins. Les transcrits mutants peuvent être spécifiquement dégradés par une désintégration messagère médiée par le non-sens, puisque le codon de terminaison prématuré est situé en amont d’un exon épissable.22
Enfin, nous avons tenté de mesurer les niveaux de myostatine dans les échantillons de sérum du patient. La myostatine est facilement détectée par Western blotting dans les échantillons de sérum de souris.3 Des approches similaires se sont avérées beaucoup plus difficiles dans les échantillons de sérum humain, probablement parce que les humains ont des niveaux de myostatine circulants plus faibles. En utilisant un anticorps contre la myostatine, nous avons d’abord concentré la myostatine dans des échantillons de sérum par immunoprécipitation, puis nous avons détecté sa présence avec un second anticorps dirigé contre la région propeptidique. Nous avons opté pour l’anticorps dirigé contre le propeptide (L8825), car il se lie plus étroitement et capte de plus petites quantités de protéines que l’anticorps contre la myostatine mature. Nous avons identifié une bande d’environ 36 kD dans le sérum de rat, correspondant au propeptide de la myostatine. Elle était présente à un degré moindre dans les échantillons de sérum de sujets témoins appariés en âge et en sexe, mais était absente dans le sérum du patient (figure 3B). Étant donné que le rapport molaire entre le propeptide et la myostatine mature dans le sérum est d’environ 1:1,15 nous concluons que l’absence du propeptide indique l’absence de myostatine mature chez le patient.