La réduction forcée de la phase G1 modifie le mode de division, le nombre de neurones et le phénotype laminaire dans le cortex cérébral

Résultats

Une exigence majeure de cette étude est la modification sélective de la TG1 des précurseurs corticaux in vivo. La progression dans la phase G1 est conduite par l’activité kinase séquentielle de la cycline D/cdk4 et de la cycline E/cdk2 (24). Cependant, il a été signalé que la cycline D exerce également des fonctions indépendantes du cycle cellulaire sur la migration et la différenciation (25, 26) et que cdk4 et cdk2 peuvent déclencher d’autres voies de signalisation (27, 28). La cycline E1 est connue pour avoir des effets moins pléiotropes. Comme il a été démontré que la cycline E1 et la cycline D1 limitent toutes deux la vitesse de la transition G1/S (29), notre stratégie a consisté à surexprimer la cycline E1 et la cycline D1 et à présenter les deux séries de résultats. Pour ce faire, nous avons utilisé l’électroporation in utero, une méthode très efficace de délivrance de plasmides d’ADN dans les précurseurs tapissant la ZV, de manière à cibler les précurseurs corticaux somatosensoriels présumés.

Nous avons coélectroporcé la cycline E1 humaine et la cycline D1 murine avec l’EGFP dans des cerveaux embryonnaires E15. Le gain de fonction (GOF) de la cycline E1 humaine et de la cycline D1 murine sera appelé respectivement GOF de la cycline E1 et GOF de la cycline D1. Les taux de coelectroporation étaient >95% (31). Les niveaux d’expression protéique de la cycline E1 et de la cycline D1 ont été mesurés en utilisant la quantification confocale du marquage immunofluorescent (3). Des niveaux significativement plus élevés de cycline E1 et de cycline D1 ont été observés dans les cellules GOF et leur progéniture que dans les cellules témoins (électroporées EGFP) (Fig. S1 A et B).

Nous avons constaté que la transfection médiée par électroporation dans la ZV déclenche une surexpression dans une cohorte synchronisée de précurseurs du cycle (voir Résultats SI, Fig. S1 C-E et Film S1), ce qui exclut l’utilisation du marquage cumulatif de BrdU et du pourcentage de figures mitotiques marquées comme techniques valables pour mesurer les paramètres du cycle cellulaire des précurseurs exprimant l’EGFP (Figs. S1 et S2 A-C). L’influence de la surexpression de cycline D1 et de cycline E1 sur la cinétique du cycle cellulaire a d’abord été évaluée ex vivo. Après une électroporation in utero ciblant le cortex dorsomédial à E14,5, une imagerie time-lapse à 2 photons a été réalisée sur des tranches organotypiques à E15,5. La période de temps entre deux mitoses successives correspond à la durée du cycle cellulaire Tc. Nous avons observé une Tc moyenne de 23 h dans les cellules EGFP+ témoins et de 19,75 h dans les cellules GOF cycline E1 et GOF cycline D1, indiquant une réduction de 15 % de la Tc dans les précurseurs GOF (Fig. 1A). En utilisant une procédure de double marquage de la phase S in vivo, nous montrons ensuite une réduction significative de Tc moins Ts (Ts : durée de la phase S) dans les précurseurs de GOF par rapport au contrôle (Fig. S2D). Pour mesurer directement le TG1 in vivo dans la population électroporcée, nous avons réalisé des injections d’EdU pulsé 8, 10 et 12 h après l’électroporation in utero à E15. Dix heures après l’électroporation, <0,05% des cellules EGFP+ des contrôles avaient incorporé de l’EdU, ceci contrastant avec les populations GOF cycline E1 et cycline D1 où 38 et 10% des cellules étaient doublement marquées, respectivement (Fig. 1B). Douze heures après l’électroporation, la proportion de cellules EdU+ EGFP+ avait considérablement augmenté dans la population GOF, atteignant 50 % (cycline E1 GOF) et 60 % (cycline D1 GOF) et contrastant avec <5 % de cellules EdU+ dans la population témoin, ce qui indique que les cellules témoins venaient juste de commencer à entrer en phase S. Comme l’EGFP n’est pas exprimé dans les cellules qui ont été électroporgées pendant la phase G1, les premières cellules EGFP+ à incorporer de l’EdU sont les cellules qui étaient en phase M au moment de l’électroporation (Fig. 1C). Cette procédure expérimentale, qui permet de mesurer la valeur minimale de TG1, indique que la TG1 est plus courte de près de 4 heures dans les populations GOF par rapport aux témoins. Il est important de noter que des réductions similaires de TG1 ont été observées dans les précurseurs de GOF Pax6+ et Tbr2+ (Fig. S2 E-G). Une TG1 plus courte dans les précurseurs surexprimant la cycline E1 et la cycline D1 a été confirmée par la fréquence plus faible de cellules présentant une coloration Ki67 ponctuée, caractéristique des cellules cyclisées en phases G1/S (17) (Fig. S3A).

Modification de l’équilibre entre les divisions prolifératives et différentielles.

Les conséquences de la réduction forcée de TG1 sur le comportement prolifératif des précurseurs corticaux ont d’abord été examinées dans des cultures dissociées sur une période de 3 jours. Les précurseurs E15 ont été transfectés par lipofection et la taille des clones individuels résultant de la transfection d’un seul précurseur a été mesurée. Le nombre moyen de cellules par clone et la distribution des tailles des clones montrent des différences significatives entre les précurseurs GOF de cycline E1 et de cycline D1 et les contrôles (Fig. 2 A et B). Alors que la taille moyenne des clones était de trois cellules (taille médiane : 1,95) dans les contrôles, avec >50% des clones étant composés d’une ou deux cellules, la taille moyenne des clones était de quatre cellules (taille médiane : 2,94 pour la cycline E1 GOF et 2,96 pour la cycline D1 GOF) dans les conditions GOF avec une forte proportion de clones composés de plus de cinq cellules.

Ki67 est exprimé pendant toutes les phases du cycle cellulaire dans la plupart des cellules, ce qui en fait un marqueur de fraction de croissance approprié (32). Les variations des proportions de cellules Ki67+ dans une population de précurseurs sont donc indicatives des variations des proportions de réentrée du cycle cellulaire (divisions prolifératives) par rapport à la sortie du cycle cellulaire (divisions différenciatives). L’immunomarquage Ki67 effectué 3 jours après la transfection a montré que la proportion de précurseurs du cycle est significativement plus élevée dans les clones GOF par rapport aux contrôles. Cela indique une fraction plus élevée de réentrée du cycle cellulaire dans les clones GOF, ce qui est cohérent avec la surexpression de cycline E1 et cycline D1 conduisant à une augmentation de la proportion de divisions prolifératives (Fig. 2 A et C).

In vivo, la GOF de cycline E1 et cycline D1 a conduit à une augmentation significative des proportions de précurseurs exprimant Ki67 dans la GZ 24 et 48 h après électroporation, confirmant la réentrée du cycle cellulaire aux dépens de la différenciation (Fig. 2D). A l’inverse, la régulation négative de la cycline D1 et de la cycline E1 via la transfection de siRNAs ciblés a conduit à une diminution des proportions de réentrée dans le cycle cellulaire (Fig. S3B). Ceci montre que la réduction forcée de TG1 favorise les divisions prolifératives des précurseurs corticaux au détriment de la neurogenèse.

Conséquences sur la taille totale du pool de précurseurs.

L’augmentation de la réentrée du cycle cellulaire induite par la FGO de la cycline D1 et de la cycline E1 a conduit à une amplification du pool de précurseurs, comme le révèle une augmentation significative de l’épaisseur de la GZ dans la région électroporée par rapport à la région équivalente non électroporée (Fig. S4 A-C et Tableau S1). Cette augmentation est détectable 48 h après l’électroporation et persiste 72 h après l’électroporation (Fig. S4A). Nous avons quantifié l’augmentation du nombre de précurseurs en comptant le nombre de cellules Ki67+ dans une colonne de 100-μm de large du cortex de E17 après électroporation de GOF à E15. Les comptages ont été comparés sur des coupes coronales entre la région électroporée et la région homologue de l’hémisphère témoin. Les résultats montrent une augmentation significative de 25% du nombre de précurseurs Ki67+ (Fig. S4D). La zone clairsemée de cellules prolifératives Ki67+ située dans la partie inférieure de la ZI (33-36) contribue largement (23%, Fig. S4 E et F) à l’augmentation du nombre total de cellules prolifératives par colonne de cortex dans les conditions GOF.

Conséquences séquentielles et spécifiques aux lignées sur les précurseurs exprimant Pax6 et Tbr2.

Nous avons étudié l’impact du raccourcissement de TG1 sur les pools de précurseurs de BPs Pax6 et Tbr2 en division apicale. L’immunomarquage PH3 réalisé 72 h après l’électroporation à E15 révèle une augmentation significative du nombre de précurseurs dans la VZ subissant une mitose basale chez les précurseurs de GOF par rapport aux témoins (Fig. 3C). Les mesures de l’épaisseur absolue de la VZ et de la SVZ effectuées dans des loci strictement correspondants entre les régions électroporées témoins et GOF ont montré une augmentation significative (30 à 50%) de l’épaisseur de la SVZ à 48 et 72 h (Fig. S4 B et C et Tableau S1). En revanche, aucune variation significative de l’épaisseur de la ZVC n’a été observée (Fig. S4C et Tableau S1). L’augmentation de la mitose basale dans les conditions GOF cycline E1 et cycline D1 est probablement responsable de l’augmentation de l’épaisseur de la ZVS.

Nous avons analysé indépendamment et séquentiellement les conséquences de la GOF de cycline E1 et de cycline D1 sur la prolifération des précurseurs de la VZ et de la SVZ en contrôlant le pourcentage de cellules Ki67+. Dans la VZ, on observe une augmentation de 26% des Ki67+, 24 h après l’électroporation en conditions GOF et une augmentation de 117% dans la SVZ (Fig. 3 A, B, et D et Fig. S5A). Ces augmentations sont dues à l’augmentation des proportions de cellules Ki67+ dans les populations Pax6 (Fig. 3E) et Tbr2 (Fig. 3F).

Pour explorer l’impact de la réduction de TG1 sur le destin des cellules filles générées par les divisions prolifératives, nous avons quantifié les proportions de (i) Pax6+/Tbr2-, (ii) Tbr2+/Pax6- (BPs matures), et (iii) Pax6+/Tbr2+ dans la VZ et la SVZ, 24 et 48 h après électroporation. Les cellules Pax6+/Tbr2+ correspondent aux Tbr2+ nouveau-nés, où l’expression de Pax6 n’a pas encore été régulée à la baisse (22). Vingt-quatre heures après l’électroporation, nous avons observé une augmentation significative de la proportion de cellules Pax6+ dans la VZ accompagnée d’une réduction significative des précurseurs Tbr2+ (Fig. S6A). Ceci indique qu’à ce stade, le raccourcissement de TG1 favorise les divisions prolifératives auto-renouvelantes des précurseurs de Pax6. Ceci est également confirmé par la diminution des proportions de Pax6+/Tbr2+ dans la VZ (Fig. 3G, histogrammes de gauche). Quarante-huit heures après l’électroporation, la réduction de TG1 a entraîné une diminution statistiquement significative des proportions de Pax6+ et une augmentation concomitante de Tbr2+ dans la VZ (Fig. S6B). Inversement, la régulation négative de cyclinD1 et cyclinE1 a conduit à une augmentation des proportions de précurseurs Pax6+ et à une diminution corollaire de la proportion de précurseurs Tbr2+ dans la VZ, alors qu’aucun changement n’a été observé dans la SVZ (Fig. S6B). L’augmentation observée des proportions de Tbr2 dans la VZ à 48 h est en accord avec le passage de la mitose apicale à la mitose basale observé dans les précurseurs de GOF (Fig. 3 A-C et Fig. S5). Nous avons observé une augmentation significative des proportions de précurseurs Pax6+/Tbr2+ dans les populations électroporées GOF par rapport aux contrôles (Fig. 3G, histogrammes de droite), indiquant un déplacement vers la production de précurseurs Tbr2 dans la progéniture Pax6. Cet effet est inversé par la régulation à la baisse de la cycline D1 et de la cycline E1 (Fig. S6 C et E).

Au niveau de la population, l’expression forcée de la cycline D1 et de la cycline E1 influence les précurseurs VZ en favorisant d’abord les divisions prolifératives auto-renouvelantes des cellules Pax6+. Dans un deuxième temps, les divisions prolifératives des précurseurs Pax6 se déplacent vers une génération accrue de BPs Tbr2+. La surexpression de la cycline E1 et de la cycline D1 influence le destin des précurseurs de manière similaire. Aux deux stades, la proportion de neurones post-mitotiques (cellules Pax6-Tbr2-) est statistiquement réduite dans la population GOF (Fig. S6D), confirmant une augmentation des divisions prolifératives au détriment des divisions neurogéniques différenciatives. Inversement, la régulation négative de la cycline D1 et de la cycline E1 augmente la proportion de cellules post-mitotiques dans la ZV (Pax6-Tbr2-) (Fig. S6F).

Ces résultats, ainsi que l’observation montrant des taux similaires de mort cellulaire dans les conditions de contrôle et de GOF (Fig. S6 G-I), suggèrent que deux processus pourraient contribuer à l’augmentation du pool de précurseurs de la ZVS observée 48 et 72 h après l’électroporation. Dans un premier temps, une amplification transitoire du pool de précurseurs Pax6 (peut-être via des taux accrus de divisions prolifératives symétriques auto-renouvelables), suivie d’une augmentation des divisions prolifératives des précurseurs Pax6 générant des précurseurs Tbr2 qui quittent la VZ pour la SVZ. Par la suite, une augmentation drastique de la prolifération des précurseurs Tbr2 dans la VZ et la SVZ : l’ampleur de l’augmentation des proportions de Ki67 dans les populations Tbr2 est élevée (110%) et approximativement équivalente dans la VZ et la SVZ (Fig. 3F).

Changements dans le destin laminaire et la cytoarchitecture dans le cortex postnatal.

Comme l’expression de l’EGFP est conservée pendant plusieurs semaines, nous avons pu examiner les conséquences de la surexpression de la cycline E1 et de la cycline D1 sur la production et le destin des neurones. Tout d’abord, nous avons examiné la distribution laminaire des neurones exprimant l’EGFP dans l’aire 3 (cortex somatosensoriel) et l’aire 4 adjacente au jour postnatal 15 (P15), après l’achèvement de la migration des neurones corticaux. Les neurones témoins exprimant l’EGFP sont en grande partie (90%) situés dans les couches supragranulaires (y compris la couche 4), avec des cellules éparses dans les couches infragranulaires (Fig. 4 A et B et Fig. S7 A et B). Une réduction significative de la proportion de neurones situés dans les couches infragranulaires a été observée dans la descendance GOF (10 % dans le contrôle contre 7,5 et 1,5 % dans la cycline E1 et la cycline D1, respectivement) (Fig. 4D). Dans la couche 4, les neurones de la descendance GOF étaient limités à la moitié supérieure de la couche (Fig. 4 A et B et Fig. S7 A et B), alors que les neurones de la descendance EGFP du contrôle occupent toute la largeur de la couche. Une analyse du box plot a révélé que la profondeur de la couche était statistiquement différente dans les progénitures témoins et GOF dans la couche 4 (Fig. 4C et Fig. S7C). Ces résultats indiquent qu’après le raccourcissement du TG1, les neurones sortent du cycle cellulaire plus tard au cours de la corticogenèse et produisent des neurones du phénotype prédit par leur date de naissance (37, 38).

L’impact des modifications de TG1 sur les taux de production de neurones a été mesuré via le comptage des neurones dans les régions témoins et électroporées dans les couches supra et infragranulaires du cortex P15. Cette mesure a révélé une augmentation significative de 10 % de la densité de neurones dans la couche 3 de la région électroporée par GOF par rapport au contrôle (Fig. 4E). La densité de neurones était identique dans la couche 6B et plus faible, bien que non significativement différente, dans la couche 5 de la région électroporée par GOF par rapport au contrôle (Fig. S7D). Le raccourcissement de TG1 de E15 à E17 a modifié les taux de production de neurones et les caractéristiques cytoarchitectoniques, entraînant une augmentation significative de la densité de neurones de la couche supragranulaire.

Modélisation mathématique des conséquences du raccourcissement de G1 et de l’augmentation de la réentrée du cycle cellulaire sur la production de neurones et le destin laminaire.

La modélisation des effets du GOF sur le TG1 et la réentrée du cycle cellulaire de E15 à E17 permet de prédire les changements du nombre de neurones de manière spécifique au laminaire (voir Résultats SI). L’augmentation prévue du nombre de neurones est de 26,94 % dans les couches 2/3 et une augmentation globale de 4,16 %, contrastant avec une baisse prévue dans la couche 5 de -16,84 % (Fig. S8 A-C). La chute de la couche 5 s’explique par le fait que les précurseurs de E15 qui sont les progéniteurs de la couche 5 sont amenés à subir d’autres cycles de divisions prolifératives dans des conditions GOF. En accord avec le calendrier de production des couches corticales dans la zone 3 (37, 38), le nombre de neurones de la couche 6B n’est pas affecté par les modifications des paramètres du cycle cellulaire induites par la FOB après E15 (Fig. S8D). L’accord entre les données modélisées et les observations expérimentales est bon, ces dernières montrant une augmentation de 10 % de la densité des neurones de la couche supragranulaire et une baisse modeste de la densité des neurones de la couche 5 dans les conditions GOF par rapport au contrôle (Fig. 4E et Figs. S7D et S8 B et C). Les données modélisées prédisent également les changements dans la localisation laminaire de la progéniture des précurseurs GOF en bon accord avec les données expérimentales (Fig. 4D), (réduction infragranulaire : données : 1,24 %, modèle : 3,27 %) (Fig. 4D et Fig. S4E) par rapport aux neurones nés de précurseurs témoins (données : 10 %, modèle : 16,19 %) (Fig. 4D et Fig. S4E). Ces changements sont conformes à la relation entre la date de naissance d’un neurone et son phénotype laminaire (39).