L’action de la chorismate mutase est un paradigme de la catalyse enzymatique, car l’enzyme est une protéine structurellement simple qui accélère une réaction unimoléculaire directe : un réarrangement intramoléculaire concerté du chorismate en préphénate dans lequel une liaison carbone-carbone est formée et une liaison carbone-oxygène est rompue (Fig. 1). La réaction elle-même est une étape vitale dans la biosynthèse des acides aminés aromatiques, conférant à l’enzyme une importance biologique égale à son importance dans la compréhension des mécanismes de catalyse. Dans ce numéro des PNAS, Hur et Bruice (1) ont appliqué le concept de conformation proche de l’attaque (NAC), que Bruice et ses collègues développent depuis plusieurs années (2, 3), aux accélérations produites par plusieurs chorismates mutases différents, développant ainsi ce que l’on pourrait appeler une micro-histoire du processus catalytique pour ces enzymes, retraçant les événements entre l’état réactif et l’état de transition. Les résultats sont éclairants et susceptibles de générer une surprise considérable.
Le chorismate se réarrange en préphénate : la réaction catalysée par les chorismate mutases. Très grossièrement et schématiquement, les structures représentent des conformères réactifs.
Expliquer la catalyse enzymatique a toujours représenté un défi adéquat. Les enzymes sont des catalyseurs puissants, certains accélérant leurs réactions cibles par des facteurs pouvant dépasser 1020 (4). Les mutases du chorismate accélèrent leur réaction cible par un facteur ≈106- à 107. Les détails de la façon dont de telles accélérations sont orchestrées au cours d’un processus dans lequel l’enzyme rencontre des molécules réactives, peut, dans certains cas, les guider à travers divers états intermédiaires jusqu’à la ou les molécules produits, puis libère ces dernières avant de lancer un nouveau cycle catalytique, ont fait l’objet de recherches, de spéculations et de débats depuis la découverte des enzymes.
L’un des principaux outils conceptuels permettant d’organiser les résultats a été l’intuition de Pauling (5) selon laquelle une enzyme est une biomolécule qui se lie spécifiquement et stabilise ainsi l’état de transition de la réaction cible. Lorsqu’elle est formulée dans la version habituelle du chimiste des solutions de la théorie de l’état de transition, l’idée qu’une enzyme réalise la catalyse uniquement par le biais d’une stabilisation nette de l’état de transition est un thème confortable en enzymologie mécaniste depuis un certain temps (7). Cette formulation est celle dans laquelle les constantes de vitesse de réaction telles que les familières kcat et kcat/KM augmentent avec la catalyse uniquement lorsque le catalyseur diminue la différence d’énergie libre de Gibbs entre l’état de transition et l’état réactif. Elle offre donc comme grand avantage l’indépendance par rapport au chemin des fonctions d’état thermodynamiques. L’attention peut se concentrer uniquement sur l’état de transition et l’état réactif, sans tenir compte des états intermédiaires, car leurs propriétés ne peuvent pas contribuer à la catalyse. La micro-histoire d’une réaction enzymatique pourrait donc être jugée sans intérêt car aucune de ses caractéristiques ne pourrait influencer les constantes de vitesse observables expérimentalement.
Pour beaucoup, les découvertes des une ou deux dernières décennies ont commencé à suggérer que ce compte rendu est inadéquat. En particulier, la découverte et la documentation par Klinman et ses collègues du rôle vital de l’effet tunnel quantique dans les réactions enzymatiques impliquant le transfert d’hydrogène (8), a soulevé la question de savoir exactement comment incorporer ces effets dans la description des constantes de vitesse. Des études connexes sur le couplage environnemental dans la catalyse du transfert d’hydrogène menées par Benkovic, Hammes-Schiffer et leurs collègues (9) contribuent à ce réexamen. Kuznetsov et Ulstrup (10) et Schwartz et ses collègues (11), par exemple, ont proposé des formulations alternatives à celles de la théorie de l’état de transition, tandis que Gao et Truhlar (12) ont souligné que les versions modernes de la théorie de l’état de transition, qui sont très loin d’être « ultrasimples », sont extrêmement robustes et polyvalentes. Karplus (13, 14) a examiné les perspectives d’incorporation dans la description d’autres formes actuelles et innovantes de théorie, en particulier les simulations dynamiques, afin de fournir une image plus complète et plus satisfaisante des détails de la catalyse enzymatique.
Le temps est donc clairement venu pour que notre compréhension de la catalyse enzymatique soit améliorée par des descriptions de la micro-histoire entre l’état réactif et l’état de transition, et la théorie est l’outil approprié pour cette tâche. Il reste à voir si la totalité des nouvelles informations exigera finalement une approche conceptuelle distincte, même des puissantes versions modernes de la théorie de l’état de transition. Quel que soit le cadre théorique qui sera nécessaire, les questions fondamentales susceptibles d’être éclairées semblent nombreuses. En particulier, la manière dont les structures du site actif (et peut-être des réseaux éloignés et étendus dans la structure de la protéine) agissent pour faire passer la barrière énergétique aux molécules réactives est d’un grand intérêt. Cela est particulièrement vrai pour des cas comme celui de la chorismate mutase, où les atomes qui se déplacent pour former et rompre des liaisons sont tous des atomes lourds, non hydrogène. L’effet tunnel quantique n’est alors pas une option efficace pour obtenir une accélération catalytique.
Dans leur développement de la microhistoire de la chorismate mutase, Hur et Bruice (1) considèrent cinq exemples différents de catalyse protéique ainsi que la réaction » non catalysée » en solution aqueuse. Ils montrent qu’un NAC de chorismate qui est prêt pour l’événement critique de formation de liaison (ayant la conformation globale de l’état de transition et l’orientation correcte des orbitales de réaction pour une formation de liaison sans heurts) existe dans le site actif de chaque catalyseur dans une population qui reflète exactement l’activité catalytique de ce catalyseur. Ils obtiennent l’énergie libre standard de formation de la NAC dans chaque environnement, puis soustraient cette valeur de l’énergie libre d’activation déterminée expérimentalement pour trouver l’énergie libre requise pour convertir la NAC en état de transition. Cette valeur est uniformément de 16 kcal/mol pour tous les catalyseurs et pour la réaction non catalysée en solution aqueuse libre !
Hur et Bruice ont donc montré que les interactions du catalyseur (interactions électrostatiques et hydrophobes) stabilisent une conformation proche de l’état de transition, sauf que la liaison de formation est plus longue de ≈1,5-2 Å qu’elle ne le sera dans l’état de transition. Ces interactions constituent l’intégralité des interactions attractives qui stabilisent l’état de transition. Au fur et à mesure que la formation et le raccourcissement critiques des liaisons se produisent, les interactions stabilisatrices sont maintenues quantitativement de sorte qu’une barrière uniforme de 16 kcal/mol est surmontée dans chaque cas catalytique et dans la réaction non catalysée. Lorsque l’état de transition est atteint et que la nouvelle liaison est partiellement formée, le coût énergétique du tri des conformations réactives parmi la vaste gamme de conformations du chorismate libre disparaît, la nouvelle liaison fixant la molécule dans la forme cyclique correcte. L’intégralité des interactions attractives catalyseur-substrat apparaît maintenant comme une stabilisation de l’état de transition.
Hur et Bruice identifient un certain nombre de résidus d’acides aminés qui stabilisent la NAC et l’état de transition dans une égale mesure. Ils soulignent particulièrement le rôle des résidus d’arginine qui interagissent avec les deux groupes carboxylate du chorismate pour stabiliser la conformation qui amène les deux atomes de carbone réactifs à proximité, et les résidus de valine, d’isoleucine, de leucine et de phénylalanine qui fournissent un environnement hydrophobe pour les fragments moins polaires de la molécule de chorismate lorsqu’elle est dans la conformation NAC.
Les calculs de Hur et Bruice suggèrent une explication concevable pour un résultat autrement quelque peu mystifiant de Hilvert et ses collègues (15). Ils ont créé une chorismate mutante avec un résidu citrulline électriquement neutre à la place de l’arginine 90, un des résidus impliqués dans la catalyse. En effet, la catalyse est fortement compromise, mais l’enzyme de type sauvage et l’enzyme mutante fixent un inhibiteur analogue à l’état de transition avec des constantes d’équilibre qui ne sont que légèrement différentes (1,2 et 6,8 μM). On aurait pu s’attendre à ce que l’inhibiteur, qui est structurellement contraint à une conformation ressemblant à la fois à l’état de transition et à la NAC, se lie à l’enzyme mutante de manière nettement moins forte (dans le site actif de l’enzyme mutante, seule une petite minorité du substrat se trouve sous la forme NAC, dont l’énergie libre est supérieure de 4,1 kcal/mol à celle du complexe enzyme-substrat). Hur et Bruice constatent que leurs simulations suggèrent que les interactions entre l’inhibiteur et l’enzyme mutante sont modifiées par rapport à celles de l’enzyme de type sauvage. Ainsi, il est possible que la forte liaison de l’inhibiteur par l’enzyme mutante soit un artefact de cette liaison inhabituelle.
La microhistoire des processus catalysés par les enzymes retrace les événements entre l’état réactif et l’état de transition.
La microhistoire de Hur et Bruice commence par le complexe enzyme-substrat, qui, dans les catalyseurs les plus actifs, contient une forte population de la NAC ou conformation réactive. La microhistoire peut être prolongée une étape plus tôt par une étude théorique de Guo et al. (16). Ils ont examiné la question de savoir si la très petite fraction de conformations réactives présentes parmi les nombreuses autres conformations du chorismate en solution libre est sélectionnée et spécifiquement liée par l’enzyme. L’alternative est que les conformations non réactives les plus communes peuvent également être liées et ensuite trouver leur chemin, peut-être avec l’aide de l’enzyme, vers la forme réactive. La réponse est que les conformères non réactifs sont effectivement liés et que les groupes du site actif aident à les amener et à les maintenir dans la forme réactive au fur et à mesure que le système passe dans le NAC puis à l’état de transition.
L’approche NAC ne manque pas de critiques, mais les nouvelles découvertes devraient convenir à certains d’entre eux. Dans leur étude récente du cas de la chorismate mutase, Štrajbl et al. (17) notent que, bien qu’ils identifient eux aussi un effet NAC, il devrait être préférable de centrer l’attention computationnelle sur l’état de transition « plutôt que d’évaluer l’effet NAC qui pourrait ou non aider à prédire l’effet catalytique. » Dans de nombreux cas, bien sûr, ce serait un bon conseil. Mais dans le cas particulier de la catalyse de la chorismate mutase, Hur et Bruice constatent maintenant que l’énergie libre de formation du NAC prédit précisément l’ampleur de l’effet catalytique en raison de la barrière constante de 16 kcal/mol qui est franchie, à partir de la structure du NAC, dans le cas de toutes les réactions catalysées et non catalysées qu’ils ont examinées.
Les approches théoriques du mécanisme enzymatique élargissent donc notre vision de celle imposée par les possibilités limitées d’une époque antérieure, et nous permettent d’explorer les événements à tous les points de la voie, des molécules réactives à l’état de transition.
Notes de bas de page
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