Cómo una enzima supera la barrera de energía de activación

La acción de la corismato-mutasa es un paradigma de la catálisis enzimática, ya que la enzima es una proteína estructuralmente sencilla que acelera una reacción unimolecular directa: un reordenamiento concertado e intramolecular del corismato a prefenato en el que se forma un enlace carbono-carbono y se rompe un enlace carbono-oxígeno (Fig. 1). La reacción en sí es un paso vital en la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos, lo que confiere a la enzima una importancia biológica equivalente a la que tiene para comprender los mecanismos de catálisis. En este número de PNAS, Hur y Bruice (1) han aplicado el concepto de conformación cercana al ataque (NAC), que Bruice y sus colaboradores han estado desarrollando durante varios años (2, 3), a las aceleraciones producidas por varias mutasas de corismato diferentes, desarrollando así lo que podría llamarse una microhistoria del proceso catalítico para estas enzimas, trazando los acontecimientos entre el estado reactivo y el estado de transición. Los hallazgos son esclarecedores y probablemente generarán una considerable sorpresa.

Explicar la catálisis enzimática siempre ha supuesto un reto adecuado. Las enzimas son potentes catalizadores, algunos de los cuales aceleran sus reacciones objetivo en factores que pueden superar los 1020 (4). Las corismato-mutasas aceleran su reacción objetivo en un factor de ≈106- a 107. Los detalles de cómo se orquestan estas aceleraciones en el curso de un proceso en el que la enzima encuentra moléculas reactivas, puede, en algunos casos, guiarlas a través de varios estados intermedios hasta la molécula o moléculas de producto, y luego libera estas últimas antes de iniciar un nuevo ciclo catalítico, han sido objeto de investigación, especulación y debate desde el descubrimiento de las enzimas.

Una de las principales herramientas conceptuales para organizar los descubrimientos ha sido la idea de Pauling (5) de que una enzima es una biomolécula que se une específicamente y estabiliza así el estado de transición de la reacción objetivo. Cuando se formula en la versión habitual de la teoría del estado de transición de los químicos de soluciones, la idea de que una enzima logra la catálisis sólo mediante la estabilización neta del estado de transición ha sido un tema cómodo en la enzimología mecanicista durante algún tiempo (7). Esta formulación es aquella en la que las constantes de velocidad de reacción, como las conocidas kcat y kcat/KM, aumentan con la catálisis sólo cuando el catalizador disminuye la diferencia de energía libre de Gibbs entre el estado de transición y el estado reactivo. Por tanto, ofrece como gran ventaja la independencia de la trayectoria de las funciones de estado termodinámicas. La atención podría centrarse únicamente en el estado de transición y el estado reactivo, sin tener en cuenta los estados intermedios porque sus propiedades no podrían contribuir a la catálisis. Por lo tanto, la microhistoria de una reacción enzimática podría considerarse sin interés porque ninguna de sus características podría influir en las constantes de velocidad observables experimentalmente.

Para muchos, los descubrimientos de las últimas una o dos décadas han empezado a sugerir que esta explicación es inadecuada. En particular, el descubrimiento y la documentación por parte de Klinman y colaboradores del papel vital del tunelaje cuántico en las reacciones enzimáticas que implican la transferencia de hidrógeno (8), planteó la cuestión de cómo incorporar exactamente estos efectos en la descripción de la constante de velocidad. Los estudios relacionados con el acoplamiento ambiental en la catálisis de transferencia de hidrógeno realizados por Benkovic, Hammes-Schiffer y sus colaboradores (9) están contribuyendo a esta reconsideración. Kuznetsov y Ulstrup (10) y Schwartz y sus colaboradores (11), por ejemplo, han propuesto formulaciones alternativas a las teóricas del estado de transición, mientras que Gao y Truhlar (12) han destacado que las versiones modernas de la teoría del estado de transición, que están muy lejos de ser «ultrasimples», son extremadamente robustas y versátiles. Karplus (13, 14) ha revisado las perspectivas de incorporar a la descripción otras formas actuales e innovadoras de la teoría, en particular las simulaciones dinámicas, para proporcionar una imagen más completa y satisfactoria de los detalles de la catálisis enzimática.

Por lo tanto, está claro que ha llegado el momento de que nuestra comprensión de la catálisis enzimática se vea reforzada por las descripciones de la microhistoria entre el estado reactivo y el estado de transición, y la teoría es la herramienta adecuada para la tarea. Queda por ver si la totalidad de la nueva información requerirá finalmente un enfoque conceptual distinto incluso de las potentes versiones modernas de la teoría del estado de transición. Sea cual sea el marco teórico que se necesite, las cuestiones básicas que probablemente se iluminen parecen numerosas. En particular, la forma en que las estructuras del sitio activo (y quizás las redes remotas y extendidas en la estructura de la proteína) actúan para mover las moléculas reactivas a través de la barrera de energía es de gran interés. Esto es especialmente cierto en casos como el de la corismato-mutasa, en el que los átomos que se mueven para formar y romper enlaces son todos átomos pesados, no de hidrógeno. La tunelización cuántica no es entonces una opción eficaz para lograr la aceleración catalítica.

En su desarrollo de la microhistoria de la corismato mutasa, Hur y Bruice (1) consideran cinco ejemplos diferentes de catálisis de proteínas, así como la reacción «no catalizada» en solución acuosa. Demuestran que un NAC de corismato que está preparado para el evento crítico de formación de enlaces (que tiene la conformación general del estado de transición y la orientación correcta de los orbitales reaccionantes para la formación de enlaces sin problemas) existe en el sitio activo de cada catalizador en una población que refleja exactamente la actividad catalítica de ese catalizador. Obtienen la energía libre estándar de formación del NAC en cada entorno y luego restan este valor de la energía libre de activación determinada experimentalmente para encontrar la energía libre necesaria para convertir el NAC en estado de transición. Este valor es uniformemente de 16 kcal/mol para todos los catalizadores y para la reacción no catalizada en solución acuosa libre!

Hur y Bruice han demostrado, por tanto, que las interacciones del catalizador (interacciones electrostáticas e hidrofóbicas) estabilizan una conformación parecida a la del estado de transición que se aproxima al estado de transición, excepto que el enlace de formación es más largo en ≈1,5-2 Å de lo que será en el estado de transición. Estas interacciones constituyen la totalidad de las interacciones atractivas que estabilizan el estado de transición. A medida que se produce la formación del enlace crítico y el acortamiento del enlace, las interacciones estabilizadoras se mantienen cuantitativamente de manera que se supera una barrera uniforme de 16 kcal/mol en cada caso catalítico y en la reacción no catalizada. A medida que se alcanza el estado de transición y se forma parcialmente el nuevo enlace, el coste energético de ordenar las conformaciones reactivas a partir de la amplia gama conformacional del corismato libre desaparece, y el nuevo enlace asegura la molécula en la forma cíclica correcta. La totalidad de las interacciones atractivas catalizador-sustrato aparece ahora como estabilización del estado de transición.

Hur y Bruice identifican una serie de residuos de aminoácidos que estabilizan el NAC y el estado de transición en igual medida. Destacan especialmente el papel de los residuos de arginina que interactúan con los dos grupos carboxilato del corismato para estabilizar la conformación que acerca los dos átomos de carbono reactivos, y los residuos de valina, isoleucina, leucina y fenilalanina que proporcionan un entorno hidrofóbico para los fragmentos menos polares de la molécula de corismato cuando está en la conformación NAC.

Los cálculos de Hur y Bruice sugieren una explicación concebible para un resultado, por otra parte algo desconcertante, de Hilvert y colaboradores (15). Crearon un mutante de la corismato-mutasa con un residuo de citrulina eléctricamente neutro en el lugar de la arginina 90, uno de los residuos implicados en la catálisis. Efectivamente, la catálisis está fuertemente comprometida, pero la enzima de tipo salvaje y la mutante se unen a un inhibidor análogo del estado de transición con constantes de equilibrio que son sólo ligeramente diferentes (1,2 y 6,8 μM). Cabría esperar que el inhibidor, que está estructuralmente limitado a una conformación que se asemeja tanto al estado de transición como al NAC, se hubiera unido a la enzima mutante con mucha menos fuerza (en el sitio activo de la enzima mutante, sólo una pequeña minoría del sustrato se encuentra en la forma NAC, que se encuentra a una energía libre superior a la del complejo enzima-sustrato en 4,1 kcal/mol). Hur y Bruice encuentran que sus simulaciones sugieren que las interacciones inhibidor-mutante de la enzima están alteradas respecto a las de la enzima de tipo salvaje. Por lo tanto, es posible que la fuerte unión del inhibidor por parte de la enzima mutante sea un artefacto de esta unión inusual.

Una microhistoria de los procesos catalizados por enzimas traza los eventos entre el estado reactivo y el estado de transición.

La microhistoria de Hur y Bruice comienza con el complejo enzima-sustrato, que en los catalizadores más activos contiene una alta población de la conformación NAC o reactiva. La microhistoria puede ampliarse un paso antes mediante un estudio teórico de Guo et al. (16). Consideraron la cuestión de si la pequeñísima fracción de conformaciones reactivas presentes entre las muchas otras conformaciones del corismato en solución libre es seleccionada y unida específicamente por la enzima. La alternativa es que las conformaciones no reactivas más comunes también pueden unirse y luego encontrar su camino, quizás con la ayuda de la enzima, hacia la forma reactiva. La respuesta es que las conformaciones no reactivas están efectivamente unidas y que los grupos del sitio activo ayudan a llevarlas y mantenerlas en la forma reactiva a medida que el sistema pasa al NAC y luego al estado de transición.

El enfoque del NAC no carece de críticos, pero los nuevos hallazgos deberían ser congeniales para algunos de ellos. En su reciente estudio del caso de la corismato mutasa, Štrajbl et al. (17) señalan que, aunque ellos también identifican un efecto NAC, debería ser preferible centrar la atención computacional en el estado de transición «en lugar de evaluar el efecto NAC que podría o no ayudar a predecir el efecto catalítico.» En muchos casos, por supuesto, este sería un buen consejo. Pero en el caso particular de la catálisis de la corismato-mutasa, Hur y Bruice encuentran ahora que la energía libre de la formación del NAC predice con precisión la magnitud del efecto catalítico debido a la barrera constante de 16 kcal/mol que se cruza, empezando por la estructura del NAC, en el caso de todas las reacciones catalizadas y no catalizadas que examinaron.

Las aproximaciones teóricas al mecanismo de las enzimas están, pues, ampliando nuestra visión desde la impuesta por las limitadas posibilidades de una época anterior, y permitiéndonos explorar los acontecimientos en todos los puntos de la vía, desde las moléculas reactantes hasta el estado de transición.